正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選黃連中鹽酸小檗堿醇提工藝的研究

陳程

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

黃連為毛莨科植物黃連的干燥根莖［1］。鹽酸小檗堿為黃連中含量最高的原小檗堿型生物堿，也是最重要的活性成分之一，具有抗炎、抗菌、抗癌，治療糖尿病和心血管疾病，及抑制脂肪分化等多方面藥理作用［2-3］。鹽酸小檗堿是一種季銨生物堿，其鹽類在水中溶解度低，水提不能達(dá)到很好的提取效果［4］。故本研究選用乙醇回流提取。

以鹽酸小檗堿含量和干膏得率作為評價(jià)指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選最佳醇提工藝。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

黃連飲片，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院生藥教研室鑒定為毛茛科植物黃連的干燥根莖;鹽酸小檗堿(批號110733-200806);乙腈、甲醇均為色譜純;水為雙蒸餾水;乙醇、鹽酸均為分析純。

Waters 2695 高效液相色譜儀，Waters 2695 泵，Waters 2996 二極管陣列檢測器，Empower2 色譜工作站;Fw-200 高速萬能粉碎機(jī);RE-52-05 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;梅特勒GB204 電子天平(萬分之一)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

稱取黃連藥材9 份，每份10 g，分別按L9(34)正交表安排的方案進(jìn)行提取，提取液備用。測定并計(jì)算鹽酸小檗堿含量和干膏得率。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

1.3 鹽酸小檗堿HPLC 法檢測

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀 溶 液(50 ∶50，pH 調(diào) 為4. 0)，檢 測 波 長345 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃。

1.3.2 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含10 μg 的溶液。

1.3.3 供試品溶液制備 分別精密移取0.1 mL 提取液，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干。用甲醇溶解至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取對照品溶液2，5，10，15，20 μL 進(jìn)樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)作圖，線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，y=156 548x+27 954，R2=0.999 6。表明鹽酸小檗堿在進(jìn)樣量0.02 ～0.2 μg 內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.3.5 樣品含量測定 分別注入對照品溶液和供試品溶液各10 μL 于液相色譜儀中，計(jì)算鹽酸小檗堿含量。

1.4 干膏得率的測定

精密量取提取液5 mL，置蒸發(fā)皿中水浴蒸干，減壓干燥，精密稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏得率。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由表2 可知，各因素的影響次序依次為C ＞D ＞B ＞A，即溶劑用量＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞乙醇濃度。方差分析結(jié)果表明，C(溶劑用量)因素有顯著性影響(P ＜0.05)。從實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)考慮，選定最佳工藝條件為A1B1C3D3，即50%乙醇提取3 次，每次提取時(shí)間1.5 h，3 次加醇量分別為8，6，6 倍。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的最佳工藝條件重復(fù)3次，以驗(yàn)證該提取工藝條件是否具有重現(xiàn)性，結(jié)果見表4。結(jié)果表明該提取工藝穩(wěn)定、可行。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 4 Verification experiment results(n=3)

2.3 分析方法的方法學(xué)考察

2.3.1 精密度 精密吸取對照品溶液10 μL 進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣5 次，測定鹽酸小檗堿峰面積積分值。結(jié)果RSD 值為1.01%。

2.3.2 穩(wěn)定性 精密吸取供試品溶液，于12 h 內(nèi)測定，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積RSD 值為0.55%，供試品溶液在0 ～12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性 取同一批的黃連藥材5 份，制備5份供試品溶液，測定并計(jì)算鹽酸小檗堿峰面積的RSD 值為1.37%，重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率 精密移取6 份已知含量的樣品0. 05 mL，置蒸發(fā)皿中，分別精密加入相當(dāng)0.05 mL 樣品溶液80%，100%，120%的鹽酸小檗堿對照品溶液，按照供試品溶液制備方法和色譜條件測定，測得平均回收率為99.73%，RSD 為1.01%。結(jié)果表明，本方法回收率良好。

3 結(jié)論

(1)黃連中鹽酸小檗堿的醇提最佳工藝條件為:50%乙醇提取3 次，每次提取時(shí)間1.5 h，3 次加醇量分別8，6，6 倍。該醇提工藝重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。

(2)用HPLC 法測定黃連中鹽酸小檗堿含量，該方法分離較好，穩(wěn)定可行。

［1］ 鄭漢臣.藥用植物與生藥學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006.

［2］ 崔學(xué)軍.小檗堿的藥理學(xué)研究進(jìn)展及臨床新用途［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17(7):1311-1312.

［3］ Niu Lingying，Qiao Wei，Hu Zhendong，et al.Berberine attenuates lipopolysaccharide induced impairments of intestinal glutamine transport and glutaminase activity in rat［J］.Fitoterapia，2011，82(3):323-330.

［4］ 徐媛.正交試驗(yàn)法優(yōu)選黃連中小檗堿提取工藝［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2011，18(5):60-61.