一株枯草芽胞桿菌的分離鑒定及其殺蟲活性的研究

劉 慰，秦 浩，劉 霜，劉雪梅，孫運(yùn)軍，丁學(xué)知，夏立秋

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南長沙 410081)

枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)具有典型的芽胞桿菌特征，是一類好氧、內(nèi)生抗逆孢子的桿狀細(xì)菌［1］，作為一種有益的土壤細(xì)菌，對人畜相對安全，發(fā)達(dá)的分泌系統(tǒng)和抗逆生長的孢子都讓其對多種病原菌產(chǎn)生拮抗作用［2］.枯草芽胞桿菌抗菌物質(zhì)的分離純化及抗菌作用的分子機(jī)制、拮抗基因的克隆及其表達(dá)調(diào)控等研究已經(jīng)積累了豐富的資料，所篩得的拮抗菌株數(shù)量也較多，但是應(yīng)用到殺蟲方面的菌株較少，潛力有待發(fā)掘［3］.鑒于目前農(nóng)作物生產(chǎn)中存在的病蟲害防治問題，本研究從本地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，力求獲得適合本地區(qū)的對鱗翅目害蟲具有高效殺蟲活性的枯草芽胞桿菌，為開發(fā)該菌的生物防治功能和擴(kuò)大農(nóng)作物應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ).

本試驗(yàn)首先從土樣中篩選的219 株芽胞桿菌中分離出一株枯草芽胞桿菌，在菌落形態(tài)特征、生理生化特性鑒定的基礎(chǔ)上對其16S rRNA 基因序列進(jìn)行分析，進(jìn)一步做了分子生物學(xué)鑒定.通過對棉鈴蟲和甜菜夜蛾進(jìn)行生測，發(fā)現(xiàn)其對棉鈴蟲有較明顯的殺蟲效果，并對殺蟲活性物質(zhì)進(jìn)行了初步分離純化和測定.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

1.1.2 菌種 大腸桿菌DH5α(商業(yè)化菌株，本室保存)和枯草芽胞桿菌ACCC-10619(中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供).

1.1.3 培養(yǎng)基 Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，明膠20 g，定容至1 L，pH 7.0～7.2.發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，葡萄糖3 g，牛肉膏5 g，氯化鈉2 g，硫酸錳0.05 g，硫酸鎂0.3 g，磷酸氫二鉀0.3 g，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 值為7.3～7.4.

1.1.4 主要酶和試劑 EX Taq DNA 聚合酶，各種限制性內(nèi)切酶，pMD18-T 載體，購自寶生物工程(大連)有限公司;多功能DNA 純化回收試劑盒，購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選分離和純化 將經(jīng)過熱處理的土樣稀釋，制成梯度土壤懸液，對號接種到已標(biāo)記的LB固體培養(yǎng)基平板上，多次進(jìn)行劃線分離純化，直至平板上不出現(xiàn)雜菌為止［4-5］.

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 細(xì)菌菌落形態(tài)特征 將LB 固體培養(yǎng)基上純化的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min，培養(yǎng)24 h，進(jìn)行革蘭氏染色.分別取培養(yǎng)時間段為12、24、36、48、60 h 的菌體用無菌水稀釋后，制片在光學(xué)顯微鏡、電鏡、激光共聚焦顯微鏡、掃描電子顯微鏡下觀察菌體形態(tài).

1.2.2.2 菌株生理生化特性鑒定 參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》鑒定分離菌株［6］.

1.2.2.3 16S rRNA 基因擴(kuò)增、測序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

通用引物設(shè)計(jì):通過查閱文獻(xiàn)資料，設(shè)計(jì)通用引物(Bf-F，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;Bf-R，ACGGCTACCTTGTTACGACTT)，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成.

菌落PCR 模板:取培養(yǎng)時間為24 h 的菌液1mL 至1.5 mL EP 管中，14 000 r/min，離心5 min，無菌水洗后棄上清，重復(fù)2 次;加入80 μL 無菌水打勻，煮沸10 min，立即－40 ℃急凍7～8 min;以上重復(fù)5 次;融化后，14 000 r/min，離心5 min，取上清做為PCR 模板.

PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件:反應(yīng)體系(20 μL)，10×EX Tag buffer 2 μL;dNTP mixture(2.5 mmol/L)1.6 μL;Bf-R(10 μmol/L)0.6 μL;Bf-F(10 μmol/L)0.6μL;DNA 2μL;EX Tag 酶0.2 μL;無菌ddH2O 加至20 μL.反應(yīng)條件:①預(yù)變性94 ℃5 min;②變性94 ℃45 s;③退火56.1 ℃45 s;④延伸72 ℃105 s，循環(huán)30次;⑤終延伸72 ℃10 min;⑥20 ℃保存.PCR 反應(yīng)完畢后，取PCR 產(chǎn)物2 μL 進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測.

PCR 產(chǎn)物的純化、連接載體并熱轉(zhuǎn)大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞:使用多功能DNA 純化回收試劑盒對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化后，將其與pMD18-T 載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，抽提重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR 鑒定.

測序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹:將鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，獲得分離菌株的16S rRNA 基因序列.與美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)GeneBank 中序列進(jìn)行同源性比對分析，運(yùn)用clustalx 和MEGA 軟件的Kimura-2-Parameter 模型，采用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.3 菌株殺蟲活性的測定 棉鈴蟲生測實(shí)驗(yàn)于28 ℃、(70 ±5)%相對濕度的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，將不同時段發(fā)酵液混合飼料飼喂二齡棉鈴幼蟲，72 h 后觀察并統(tǒng)計(jì)每個濃度下的死亡蟲數(shù)，每種濃度3 個板共72只棉鈴蟲，獨(dú)立重復(fù)3 次.選用中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供的一株枯草芽胞桿菌ACCC-10619 作為對照菌，培養(yǎng)至同時間取樣.

1.2.4 菌株活性物質(zhì)的初步純化分析 取生測實(shí)驗(yàn)結(jié)果中較為顯著的發(fā)酵時間段培養(yǎng)液，收集只在該時間段發(fā)酵培養(yǎng)液中出現(xiàn)或較高的峰，建立該菌株中未知?dú)⑾x活性物質(zhì)分離可行的HPLC 體系，初步確定殺蟲活性物質(zhì)在該體系HPLC 分離過程中出峰時間.使用的高效液相色譜儀為AKTA punfier 10，色譜柱為Superdex 200，柱手動上樣(Inject)，上樣量為1 mL，流動相為抽濾兩次的雙蒸水，歷時60 min，流速為0.5 mL/min，檢測波長為215、254 和280 nm.

從LB 培養(yǎng)基平板上挑取菌落，轉(zhuǎn)接到含有1.4 mL LB 液體培養(yǎng)基的1.5 mL EP 管中，在管蓋上用注射器針頭扎小孔，30 ℃，1 000 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h.12 000 r/min，3 min，離心去上清，重復(fù)3 次操作.菌體沉淀用50 μL 雙蒸水重懸.向重懸菌體中加入等體積的SDS-PAGE Loading Buffer 混勻，沸水浴10 min，12 000 r/min，4 min，離心取上清用于SDS-PAGE 實(shí)驗(yàn).

根據(jù)HPLC 收集、并經(jīng)生測驗(yàn)證的殺蟲活性峰進(jìn)行SDS-PAGE 初步檢測，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行菌株發(fā)酵液上清SDS-PAGE 全蛋白電泳分析，從電泳凝膠上確定相應(yīng)的活性峰目的蛋白質(zhì)條帶，小心切下經(jīng)酶解處理后進(jìn)行質(zhì)譜(LTQ-MS)分析.

2 結(jié)果和分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態(tài)特征 分離到的菌株呈現(xiàn)短桿狀，長約4 μm，寬約0.8～1 μm，革蘭氏陽性，菌體可排成長鏈狀，內(nèi)有橢圓芽孢.菌落邊緣不整齊，表面有皺褶、隆起，粗糙不透明，呈污白色或微黃色，見圖1.

圖1 HX08 菌體細(xì)胞和芽孢形態(tài)的掃描電子顯微鏡觀察(A:3 000×;B:10 000×)和激光共聚焦顯微鏡觀察(C)Fig.1 The bacteria cell and spore morphology of HX08 by scanning electron microscope(A:3 000×;B:10 000×)and confocal laser scanning microscopy(C)

2.1.2 生理生化特征鑒定 分離菌株的生理生化鑒定結(jié)果如表1所示.

表1 HX08 菌株生理生化特征鑒定Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of the strain HX08

2.1.3 16S rRNA 序列的PCR 擴(kuò)增結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析 將發(fā)酵菌液進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，在1 500 bp 左右檢測到較亮條帶(圖2).將PCR 產(chǎn)物純化并連接pMD18-T 載體，熱激轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α 中，挑取7～8 個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α 的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行重組質(zhì)粒PCR 檢測(圖3)，提取PCR 檢測為陽性的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切得到約1 500 bp 的插入片段和約2 656 bp 的T 載體片段(圖4)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子交上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，獲得新菌株HX08 的16S rRNA 基因序列.

圖2 PCR 擴(kuò)增分離菌株16S rRNA 基因瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose electrophoresis of the PCR amplification of 16S rRNA from the strain HX08

圖3 連接pMD18-T 重組子瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose electrophoresis of PCR amplification from the ecombinant plasmids

圖4 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳檢測圖Fig.4 Agarose electrophoresis of the PCR amplification from the enzyme identification

測序結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的16S rRNA 長度為1 567 bp，確定該菌株屬于枯草芽胞桿菌屬，將其命名為HX08，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5).

圖5 HX08 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree of the strain HX08 based on 16S rRNA gene sequences

2.2 HX08 菌株殺蟲活性研究

將HX08 菌株發(fā)酵液按照不同體積混合等量的飼料飼喂棉鈴蟲幼蟲.生測結(jié)果計(jì)數(shù)如表2所示.

同時將表2 數(shù)據(jù)輸入SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件中計(jì)算其半致死濃度(LC50)和95%置信區(qū)間，得到HX08 菌株與對照菌株對棉鈴蟲幼蟲的生物統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果(表3).

表2 HX08 和對照菌對棉鈴蟲幼蟲的生物活性測定結(jié)果比對Tab.2 Toxicity of B.S.strain against Helicoverpa armigera

表3 HX08 菌株對棉鈴蟲幼蟲的殺蟲效果Tab.3 The insecticidal efficacy of the strain HX08 against Helicoverpa armigera

從表3 可以看到，HX08 菌株的LC50約為597.6 μL，對照菌的LC50約為916 μL.將表3 數(shù)據(jù)分成兩組輸入SPSS 軟件中，使用軟件中的“配對樣本t 檢驗(yàn)”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，得到分析結(jié)果(表4).通過SPSS軟件得出實(shí)驗(yàn)菌株的SD=597.611 7 ±82.194 67，對照菌株的SD=916.154 7 ±64.722 37.從表4 結(jié)果可以看到，兩組數(shù)據(jù)的LC50在95%置信區(qū)間內(nèi)計(jì)算的差異顯著性值(sig.)為0.000，即P ＜0.05;且t 值為9.943，即t ＞2.015，由以上結(jié)果可判定兩株菌株的LC50具有顯著差異，實(shí)驗(yàn)菌株的殺蟲活性高于對照菌株.

表4 HX08 菌株對棉鈴蟲幼蟲毒力的差異顯著性分析Tab.4 The significance level of the strain HX08 against Helicoverpa armigera

2.3 殺蟲活性物質(zhì)的分離與純化

上述生測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HX08 菌株60 h 發(fā)酵培養(yǎng)液的殺蟲效果較為明顯，故擬采用高效液相色譜對60 h 發(fā)酵液進(jìn)行分離純化.發(fā)酵液經(jīng)HPLC 分離后共獲得58 管收集液，收集各峰液體凍干，用于殺蟲活性測定，發(fā)現(xiàn)31～32 管即2 號峰處活性較高(圖6).由此推斷，殺蟲活性物質(zhì)出峰的時間大約為收集到第15 mL處的時間，即約31 min 處.

由生測結(jié)果看出，新菌株HX08 與中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供的枯草芽胞桿菌ACCC-10619均有殺蟲效果，但是效果差異較為明顯.分別對兩株菌全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 檢測分析，兩株菌的SDSPAGE 全蛋白圖譜顯示有相似性，但存有一定的差異，分離菌株HX08 在25 000 處有一條較亮條帶(圖7)，同時后續(xù)生測實(shí)驗(yàn)證明此條帶具有殺蟲活性.

將目的條帶經(jīng)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，該蛋白峰值較好，并出現(xiàn)連續(xù)的y、b 離子，用Thermo Proteome Discoerer 軟件檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定，檢索得到4 種蛋白，其中排在首位的蛋白代號J7JRS4，質(zhì)譜檢測出的肽段質(zhì)量與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白指紋進(jìn)行匹配，吻合度達(dá)到了46.3%，搜索枯草芽胞桿菌蛋白質(zhì)分子庫確定為草酸脫羧酶(Oxalate decarboxylase)，特異性肽段數(shù)為7 條，其他在數(shù)據(jù)庫中檢索出的蛋白質(zhì)的得分值和吻合肽段數(shù)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于草酸脫羧酶的檢索結(jié)果(圖8).

圖6 新菌株HX08 活性物質(zhì)的HPLC 分析Fig.6 HPLC chromatograms of activity produced by the strain HX08

圖7 HX08 菌株SDS-PAGE 圖譜分析Fig.7 SDS-PAGE pattern analysis of the strain HX08

圖8 HX08 菌株殺蟲活性蛋白LTQ-MS 圖譜Fig.8 LTQ-MS pattern of bioactive protein

3 討論

根據(jù)該菌在平板上的菌落形態(tài)，初步推斷為芽胞桿菌類，故采用高溫法篩選，優(yōu)化了菌株的分離過程，提高了分離效率.本研究通過一系列方法，對從湖南長沙市采集到的土樣中利用高溫條件篩選到的219 株芽胞桿菌中，分離得到一株新菌株并進(jìn)行了鑒定和歸類.將測得的16S rRNA 基因序列在NCBI 中以blast 搜尋，該株菌與Bacillus subtilis strain CU12(JX489167.1)具有很高相似性，序列相似性為99%，可認(rèn)為屬于枯草芽胞桿菌中一個新的菌株(HX08).

研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis 在低pH 環(huán)境下也可以誘導(dǎo)合成草酸脫羧酶［7-8］，枯草芽胞桿菌生防菌株Bs-916 可產(chǎn)生抗菌蛋白對核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)的菌絲生長具有明顯的抑制作用，隨后鑒定該蛋白為草酸脫羧酶［9-10］.該酶單體結(jié)構(gòu)含有2 個結(jié)構(gòu)相似的cupin結(jié)構(gòu)域，并且在每個域的中心部位含有一個金屬結(jié)合位點(diǎn)，和周圍的氨基酸殘基結(jié)合成為雙核中心，另外它的N-末端還含有短螺旋突出肽鏈［8］，該酶的Mn2+催化活性中心可能主要是在結(jié)構(gòu)域II 的結(jié)合位點(diǎn)上［11-16］，本研究分離出的活性物質(zhì)的具體殺蟲機(jī)理需要進(jìn)一步深入研究.HX08 菌株60 h 的發(fā)酵液殺蟲效果更為明顯，說明進(jìn)入生長穩(wěn)定期后菌株的殺蟲活性物質(zhì)仍然繼續(xù)增加，能提高殺蟲效果.鑒于目前市場很少有能有效防治鱗翅目害蟲的枯草芽胞桿菌微生物制劑［17-18］，本實(shí)驗(yàn)分離出對棉鈴蟲等鱗翅目害蟲有致死毒力的殺蟲菌株，對研究草酸脫羧酶殺蟲作用分子機(jī)制及研發(fā)新型殺蟲劑提供了重要基礎(chǔ)，為生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供支撐.

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