逆境脅迫下苜蓿乙醛脫氫酶基因的表達

許文花，文亦芾，馬向麗，羅富成，任 健

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201））

植物生長過程，要經(jīng)受低溫、鹽害、干旱等各種不利環(huán)境造成的逆境脅迫，逆境的影響廣泛涉及各種植物生理和生化過程，嚴重時影響植物的正常生長甚至導(dǎo)致死亡［1，2］。研究植物對逆境脅迫的生理反應(yīng)，不僅是認識植物與環(huán)境關(guān)系的一條重要途徑，有助于揭示植物適應(yīng)逆境的生理機制，而且也為生產(chǎn)中保護植物免受逆境傷害，提高其抗逆性，創(chuàng)造有利于植物生長發(fā)育的環(huán)境條件提供理論基礎(chǔ)［3］。

了解基因在逆境脅迫中的作用，是植物生理研究的重要領(lǐng)域。乙醛脫氫酶被認為是與逆境有很大關(guān)系的一類酶類，它是生物體內(nèi)活性氧物質(zhì)清除過程中的重要酶類，它可以催化有毒的醛類氧化，形成對應(yīng)的無毒羧酸，維持生物機體中醛類物質(zhì)的微量平衡；乙醛脫氫酶能有效降低乙醛的濃度，促進乙醇的消化代謝。因此，乙醛脫氫酶起著實質(zhì)性消化乙醇的作用，是乙醇消化代謝過程中的關(guān)鍵性酶，乙醛脫氫酶催化乙醛與乙酸之間的相互轉(zhuǎn)化過程，這些作用是在有關(guān)植物乙醇消化代謝過程中了解的較少的環(huán)節(jié)。

試驗研究表明，在誘導(dǎo)條件下用熒光定量法（RT－PCR）數(shù)據(jù)表明羊草乙醛脫氫酶基因的表達量呈先升高后降低的趨勢。總體分析表明，該基因?qū)}的影響要高于干旱和冷凍［4］。半定量RT－PCR研究齒肋赤蘚乙醛脫氫酶，結(jié)果表明在干旱脅迫狀態(tài)時的表達量顯著高于水合狀態(tài)，說明乙醛脫氫酶基因可能參與干旱脅迫應(yīng)答。為進一步研究齒肋赤蘚乙醛脫氫酶基因的抗旱機理提供理論依據(jù)［5］。轉(zhuǎn)乙醛脫氫酶基因番茄的研究表明，植株對環(huán)境脅迫造成的傷害具有較強的抗性，即乙醛脫氫酶基因具有提高植物抗氧化脅迫的功能［6］。

苜蓿屬于比較耐逆境脅迫的植株，根系強大，入土很深，在不同的地區(qū)都適應(yīng)生長，從逆境脅迫下苜蓿乙醛脫氫酶基因的表達調(diào)控方面深入研究，以期從分子水平揭示苜蓿植株的逆境生理。

1 材料和方法

1.1 試驗地自然概況

試驗地選擇昆明市北郊云南農(nóng)業(yè)大學(xué)的草學(xué)實習(xí)基地，地理位置為 N 25°01′，E 103°00′，海拔1 913m，年平均溫度14.7℃ 。年降水量900～1 100mm，年日照時數(shù)2 411.8h，pH 6.5。屬北亞熱帶高原季風(fēng)氣候，干濕分明，6～10月份為雨季，11月至次年5月底為旱季。

1.2 材料與儀器、試劑

1.2.1 試驗材料 紫花苜蓿種子于2012年12月種植，試驗用提取核酸的苜蓿幼苗采于次年4月。

1.2.2 試驗儀器和試劑 PCR儀（AB公司Gene－Amp PCR system 9700）；實時熒光定量 PCR 儀（AB公司7500Fast Real－Time PCR Systems）；GEL DOC 2000凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO－RAD公司）；低溫高速離心機（Legend Micro 21，美國 Thermo公司）；臺式高速離心機（Fresco 21，美國 Thermo公司）；Bio－Rad POWER Pac 1000 穩(wěn)壓電泳儀（美國BIO－RAD公司）。

植物總RNA提取試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司，cDNA 合成試劑盒（TransScript One－Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）和熒光定量PCR試劑盒（TransStart Top Green qPCR SuperMix）均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，2×Master MixTaq酶、DNA MarkerⅠ均購自北京天根生化科技（北京）有限公司，DEPC購自TaKa－Ra公司，GoldViewTM核酸染料購自北京賽百勝基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品，氯仿、無水乙醇等試劑全部為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 鹽、低溫、干旱的脅迫處理 選取生長一致的苜蓿幼苗，洗凈根系上的泥土，設(shè)3個處理，3次重復(fù)，每個重復(fù)取苜蓿幼苗10～20株，培養(yǎng)于500mmol／L NaCl溶液進行鹽脅迫處理，在水溶液中放置于4℃冰箱為冷凍處理，于20%PEG溶液培養(yǎng)進行干旱處理，處理0、4、8、12和24h取葉片，液氮速凍后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總RNA提取 取新鮮嫩葉約2 000mg，放入預(yù)冷的研體中，迅速加入液氮充分研磨，收集粉末于離心管中，加入 Trizol Reagent 1mL，4℃、12 000r／min離心5min，離心后吸取上清液于新的離心管中，加入等體積異丙醇，離心沉淀棄上清液，用75%乙醇洗滌沉淀，DNaseI酶解可能混雜的基因組DNA，然后用適量的DEPC處理過的水溶解RNA，在紫外分光光度計上測定RNA的濃度和純度。

1.3.3 cDNA的合成 按照北京全式金公司產(chǎn)品提供試劑盒使用說明合，反轉(zhuǎn)錄程序42℃30min，85℃5min，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 RT－PCR 反應(yīng) 參照苜?；蚪M（http：∥medicagohapmap.org）乙醛脫氫酶基因（GeneID：Medtr3g026140）mRNA序列和Actin基因（GeneID：Medtr 3g095530），結(jié)合Primer 5.0的設(shè)計和Oligo 6.0評價，并用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Primer－Blast工具確認引物的特異性，用于苜蓿乙醛脫氫酶基因和Actin基因的熒光定量PCR擴增。引物由上海生物工程有限公司合成。配制混合液體，混合后，取20μL于平行孔中。反應(yīng)程序：95℃30s；95℃3s，56℃30s：共45次循環(huán)；Dissociation：自動添加反應(yīng)總體系：20μL。

1.3.5 Real time PCR 數(shù)據(jù)分析：采用比較 CT 法（△△CT），數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值。Spss 17.0進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿乙醛脫氫酶基因和β－actin基因的PCR擴增

通過瓊脂糖凝膠電泳，檢測到苜蓿乙醛脫氫酶基因和β－actin基因的PCR擴增DNA的片段（圖1）。

圖1 苜蓿乙醛脫氫酶基因和β－actin基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of aldehyde dehydrogenase gene andβ－actin gene

2.2 乙醛脫氫酶基因在苜蓿不同組織部位的表達

取苜蓿的葉、莖、根通過上述測定方法，結(jié)果顯示在葉片部分的表達量為1.05，在莖的表達量為0.76，在根的表達量為0.03。研究中取葉片作為苜蓿乙醛脫氫酶表達量的測定是較理想的材料。

2.3 鹽脅迫處理下苜蓿葉片乙醛脫氫酶基因的表達變化

鹽脅迫處理下，苜蓿植株葉片的乙醛脫氫酶基因的表達量發(fā)生了變化（表1），與對照相比處理4h，葉片中乙醛脫氫酶含量下降，處理8h的含量也相對小于處理4h，而鹽脅迫處理12h的含量相對對照、處理4h、處理8h的含量升高。鹽脅迫處理24h的表達量相對下降，低于處理12h的含量。乙醛脫氫酶基因調(diào)控著機體內(nèi)部的變化，在不同處理時間下機體內(nèi)的乙醛脫氫酶發(fā)生著微妙的變化，不同處理間相差顯著，表明RT－PCR能夠檢測到苜蓿植株體內(nèi)的乙醛脫氫酶的微妙的變化，是對逆境產(chǎn)生這種變化的適應(yīng)的結(jié)果。表明苜蓿植株對鹽脅迫表現(xiàn)出明顯的適應(yīng)性，比較敏感。

表1 逆境脅迫下苜蓿乙醛脫氫酶基因相對表達量Table1 The expression of ALDH gene under the salt stress

2.4 低溫脅迫下苜蓿葉片乙醛脫氫酶基因的表達

低溫處理下，RT－PCR能夠準確的檢測到苜蓿葉片乙醛脫氫酶含量發(fā)生的變化（表1），不同處理間相差顯著。與對照相比低溫處理4h含量低于對照，低溫處理8h的苜蓿葉片乙醛脫氫酶含量高于處理4h的，低溫處理12h含量低于處理8h含量，低溫處理24h的含量低于低溫處理12h的含量。低溫條件下苜蓿乙醛脫氫酶對逆境表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性，表達量有升有降。

2.5 干旱脅迫下苜蓿葉片乙醛脫氫酶基因的表達

苜蓿在干旱脅迫處理下，乙醛脫氫酶的表達量很少，但RT－PCR能夠檢測到很少的變化，表明在逆境條件下能夠運用RT－PCR技術(shù)直觀的檢測到其微妙變化。干旱脅迫處理4h時植株基本沒有表達，干旱處理8h植株乙醛脫氫酶含量的表達量高于4h低于對照，干旱處理12h時低于處理8h、對照。干旱處理24h苜蓿乙醛脫氫酶的表達量高于處理12h的低于對照。乙醛脫氫酶基因的表達量顯示苜蓿植株對干旱脅迫處理下表現(xiàn)出明顯的調(diào)節(jié)作用，乙醛脫氫酶基因的表達量顯示植株對干旱脅迫很敏感，不同處理間相差顯著，對逆境表現(xiàn)出很大的不適應(yīng)特征。

3 討論

在逆境脅迫下植株體內(nèi)發(fā)生很多的生理和生化反應(yīng)，是對外界環(huán)境的一種適應(yīng)性。在逆境脅迫下，苜蓿乙醛脫氫酶的表達量的變化能夠反應(yīng)出對環(huán)境的適應(yīng)性，其中，對鹽脅迫處理的適應(yīng)性高于低溫處理，高于干旱處理。干旱處理下植株乙醛脫氫酶的表達量的變化說明環(huán)境的調(diào)節(jié)機制較小，表達量很小。從生理角度講各種逆境條件如干旱、高鹽、低溫、水淹或重金屬等環(huán)境脅迫，都可以使活性氧物質(zhì)（ROS）在植物細胞中快速、大量的積累，從而造成氧化脅迫。氧化脅迫的危害一方面是活性氧物質(zhì)直接損傷蛋白質(zhì)、氨基酸和核酸，并導(dǎo)致膜脂的過氧化反應(yīng)［7，8］；另一方面是膜脂的過氧化反應(yīng)能產(chǎn)生一些如醛類、烴類、酮和羥酸類等高活性的、有毒的化學(xué)物質(zhì)，毒害細胞甚至導(dǎo)致細胞死亡［9－12］。醛是膜脂過氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物，是一種活性氧誘導(dǎo)的高毒性物質(zhì)，它對核酸、氨基酸和蛋白質(zhì)等會造成嚴重傷害［13］，最終導(dǎo)致細胞死亡。細胞內(nèi)酶系統(tǒng)的水解活性大于合成活性，氧化活性大于還原活性。試驗中在各種逆境脅迫下植株葉片的乙醛脫氫酶基因表達量有升有降，表明逆境下植株的各種代謝活動減弱，植株表現(xiàn)出對環(huán)境極大的不適應(yīng)性。乙醛脫氫酶基因的表達在不同的處理條件下，有升高也有下降的，在處理的這段時間內(nèi)，植株生理機制發(fā)生著微妙的變化，尤其在鹽處理、低溫處理下植株表現(xiàn)出健壯生長。而在干旱處理下植株表現(xiàn)葉片變薄、萎焉。乙醛脫氫酶基因的表達量很少和基本不表達，表現(xiàn)出對環(huán)境的另一種適應(yīng)性。

4 結(jié)論

通過對苜蓿葉、莖、根的乙醛脫氫酶基因表達量的測定，結(jié)果表明，葉片的表達量較高，熒光定量PCR能夠檢測到逆境脅迫下的苜蓿植株的乙醛脫氫酶的基因表達量的微妙的變化。能夠把這種方法運用到逆境生理方面；各種脅迫處理條件下苜蓿植株乙醛脫氫酶的表達量不同，在不同的處理時間下苜蓿葉片的乙醛脫氫酶基因的表達量不同。

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