酶法合成阿托伐他汀側(cè)鏈中間體(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的研究進(jìn)展

葉晶晶，董思川，柳志強(qiáng)，鄭裕國

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，浙江 杭州 310014)

1 引言

他汀類藥物是上世紀(jì)80年代末開發(fā)的一類降血脂藥物，目前已發(fā)展到第三代，即全合成他汀，主要有氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀等。其中，美國Pfizer公司開發(fā)的阿托伐他汀(商品名利普妥，Lipitor)是第一個(gè)年銷售額超過100億美元的重磅藥物，自2000年起，便蟬聯(lián)全球暢銷藥銷售榜首12年，為Pfizer公司賺取約1300億美元的收入，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 阿托伐他汀

2011年，阿托伐他汀專利到期，對其合成工藝的改進(jìn)尤其是手性側(cè)鏈制備新工藝的開發(fā)再次引起各界關(guān)注。傳統(tǒng)的全化學(xué)合成工藝存在部分反應(yīng)條件苛刻，環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，因此近年來利用生物酶法合成阿托伐他汀側(cè)鏈中間體逐漸成為研究熱點(diǎn)。本文著重介紹近年來酶法合成在阿托伐他汀側(cè)鏈中間體 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(Ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate, (S)-CHBE)中的應(yīng)用。

2 酶法合成在 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用

(S)-CHBE通過對C4上氯進(jìn)行取代得到(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯(Ethyl(R)-4-cyano-3-hydroxybutanoate,HN)，因此是阿托伐他汀手性側(cè)鏈合成的關(guān)鍵手性中間體。此外，(S)-CHBE還可用于合成海洋溴吡咯生物堿Slagenins B和C、1,4-二氫吡啶類β-阻滯劑及抗艾滋藥物重要中間體(S)-3-羥基四氫呋喃等。(S)-CHBE的化學(xué)合成以 (S)-環(huán)氧氯丙烷為底物在0℃加入氰化鈉開環(huán)得到(S)-4-氯-3-羥基丁腈，再經(jīng)過乙醇醇解合成(S)-CHBE?；蛘咭?-氯乙酰乙酸乙酯 (Ethyl 4-chloroacetoacetate,COBE)為底物，利用手性釕催化劑對羰基進(jìn)行不對稱加氫還原生成(S)-CHBE。前者反應(yīng)需在低溫條件下進(jìn)行，能耗巨大，且使用有毒有害試劑；而后者催化劑不易獲得，對生產(chǎn)設(shè)備要求高。隨著生物催化轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，其反應(yīng)條件溫和，立體選擇性高，成本相對低廉，且環(huán)境友好的優(yōu)勢日益突出，逐漸受到人們關(guān)注。因此，利用酶法合成(S)-CHBE成為研究熱點(diǎn)。

(S)-CHBE的酶法合成主要分為兩種，即外消旋體手性拆分及不對稱還原。外消旋體手性拆分是指通過脂肪酶或者微生物細(xì)胞將CHBE外消旋體分離成單一的對映異構(gòu)體。不對稱還原是指利用羰基還原酶對COBE上羰基進(jìn)行不對稱加氫合成(S)-CHBE。

2.1 脂肪酶等在(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯合成中的應(yīng)用

黃泱等[1]利用CHBE與乙酸乙烯酯在脂肪酶催化下發(fā)生轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)生成4-氯-3-乙酰氧基丁酸乙酯(CABE)和乙醛，可以得到e.e.值達(dá)到50%的(R)-CHBE。 Hoff等[2]以 Rhizomucor miehie脂肪酶作為催化劑，在苯中催化CHBE與丙酸乙烯酯進(jìn)行不對稱轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，所得產(chǎn)物e.e.值可達(dá)到87%左右。以上兩個(gè)例子屬于典型的酶促手性拆分手段，經(jīng)過相應(yīng)處理后，均可獲得兩個(gè)對映體純的CHBE。

另外，也可以利用微生物細(xì)胞對CHBE進(jìn)行不對稱轉(zhuǎn)化。Suzuki等[3]利用兩種Pseudomonas sp靜息細(xì)胞對外消旋CHBE進(jìn)行動力學(xué)脫鹵，Pseudomonas sp OS-K-29可將(R)-對映體轉(zhuǎn)化為相應(yīng)二醇，所得 (S)-CHBE產(chǎn)率 33%，e.e.＞98%；而Pseudomonas sp DS-K-NR818可將 (S)-對映體轉(zhuǎn)化為(S)-3-羥基-γ-丁內(nèi)酯，所得(R)-CHBE產(chǎn)率40%，e.e.＞98%。

利用外消旋體拆分法制備手性CHBE的理論收率僅50%，且產(chǎn)物為混合物，不易分離，與潛手性羰基化合物不對稱還原制備手性醇相比處于劣勢。因此，研究者更關(guān)注CHBE的生物不對稱合成方法。

2.2 羰基還原酶在(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯合成中的應(yīng)用

酶法不對稱還原合成 (S)-CHBE的催化劑羰基還原酶(Carbonyl reductase，EC 1.1.1.184)屬于短鏈脫氫/還原酶(Short-chain dehydrogenases/reductases，SDR)超家族，多為NADPH輔酶依賴型的單亞基胞內(nèi)酶，廣泛存在于各種微生物中。羰基還原酶可將潛手性酮類化合物不對稱還原為手性醇，常被用于手性藥物中間體或精細(xì)化工產(chǎn)品的合成。利用羰基還原酶將COBE不對稱還原合成(S)-CHBE的過程需要NAD(P)H參與，而微生物細(xì)胞通常具備完整的輔酶再生系統(tǒng)，可以通過添加輔助底物實(shí)現(xiàn)輔酶再生，其原理如圖2所示。

目前，國內(nèi)外研究者已經(jīng)從多種微生物中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)(S)-CHBE的羰基還原酶，并對其進(jìn)行了研究。早在1990年，Shimizu等[4]便篩選到一株Trichosporon cutaneum AKU 4864，以其作為催化劑將30 mM COBE還原為(S)-CHBE，最終(S)-CHBE摩爾產(chǎn)率為85%，e.e.值達(dá)到91%，而之前的報(bào)道多為利用微生物進(jìn)行 (R)-CHBE的生產(chǎn)。隨后，Patel等[5]利用 Geotrichum candidum SC 5469將10 g/L COBE不對稱還原為 (S)-CHBE，產(chǎn)率為95%，e.e.值96%，通過將細(xì)胞置于55℃熱處理30 min可將產(chǎn)物e.e.值提高至99%。2010年，Kaliaperumal等[6]將 Candida parapsilosis ATCC 7330 用于(S)-CHBE的合成，采用底物分批補(bǔ)料的方式，同時(shí)在90 min加入新鮮細(xì)胞，反應(yīng)12 h后 (S)-CHBE濃度達(dá)到1.38 M(230 g/L)，產(chǎn)率為95%，e.e.值大于99%。隨后，樂庸堂[7]以Candida parapsilosis CCTCC M 203011全細(xì)胞進(jìn)行催化，通過產(chǎn)物外回路移除反應(yīng)器解除產(chǎn)物對細(xì)胞的抑制作用。將底物COBE和輔助底物葡萄糖以等摩爾比配成4 g/L溶液進(jìn)行流加，同時(shí)根據(jù)反應(yīng)速率對流加速率進(jìn)行調(diào)整，流出液中產(chǎn)物用樹脂進(jìn)行吸附。最終，(S)-CHBE濃度可達(dá)到308 g/L，產(chǎn)率達(dá)到97.2%，較兩相體系(230 g/L)提高33.9%。同時(shí)這也是目前報(bào)道利用野生型菌株催化合成 (S)-CHBE的最高濃度。另外，研究者們也從Cylindrocarpon sclerotigenum，Aureobasidium pullulans，Saccharomyces cerevisiae等微生物中篩選到可以還原(S)-CHBE的野生型菌株。表1列舉了部分用于合成(S)-CHBE的羰基還原酶。

圖2 羰基還原酶催化COBE合成(S)-CHBE

生物法不對稱還原生產(chǎn)(S)-CHBE優(yōu)勢顯著，與化學(xué)法相比具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高、設(shè)備投入低、綠色環(huán)保等優(yōu)勢；與手性拆分法相比，克服了單個(gè)對應(yīng)異構(gòu)體最高收率50%及產(chǎn)物分離困難的缺陷。然而從自然界篩選到的微生物對底物及產(chǎn)物的耐受力不高，胞內(nèi)存在的眾多酶系導(dǎo)致產(chǎn)率及對映體選擇性下降，而基因工程技術(shù)的普及，在改善微生物催化性能上發(fā)揮了重要作用。

3 酶法合成 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯輔酶再生系統(tǒng)的構(gòu)建

為了提高反應(yīng)催化效率，減少細(xì)胞內(nèi)其它酶系對產(chǎn)物產(chǎn)率及對映體選擇性的影響，通常利用基因工程手段將羰基還原酶進(jìn)行克隆表達(dá)，同時(shí)構(gòu)建輔酶再生系統(tǒng)。

目前，用于不對稱還原反應(yīng)的輔酶再生系統(tǒng)有兩種：雙酶耦聯(lián)型輔酶再生系統(tǒng)及底物耦聯(lián)型輔酶再生系統(tǒng)。其中，雙酶耦聯(lián)系統(tǒng)通過兩種酶催化不同的氧化還原反應(yīng)完成輔酶循環(huán)，是常用的氧化還原催化體系，可將甲酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、醇脫氫酶與羰基還原酶進(jìn)行耦聯(lián)構(gòu)建輔酶再生系統(tǒng)。而底物耦聯(lián)系統(tǒng)則是通過同一種酶催化不同的氧化還原反應(yīng)完成輔酶循環(huán)，由于需要酶同時(shí)具備氧化及還原能力，且底物與輔助底物必須與不同的活性中心結(jié)合，因此報(bào)道較少。

3.1 雙酶耦聯(lián)型輔酶再生系統(tǒng)

Kizaki等[18]將Candida magnoliae來源的羰基還原酶S1與Bacillus megaterium來源的葡萄糖脫氫酶在大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，并將其用于(S)-CHBE的不對稱合成。采用分批補(bǔ)加底物的策略進(jìn)行反應(yīng)，水相體系中(S)-CHBE的濃度達(dá)到208 g/L。當(dāng)使用兩相體系時(shí)，(S)-CHBE在有機(jī)相的濃度可達(dá)430 g/L，其摩爾轉(zhuǎn)化率為85%，產(chǎn)物e.e.＞99%。后來，又有學(xué)者做了S1輔酶依賴型的研究，使其可以利用NADH進(jìn)行輔酶循環(huán)，最終得到 163 g/L(S)-CHBE，e.e.＞99%。 Yamamoto[11]等將K.aestuarii來源的羰基還原酶KaCR1與葡萄糖脫氫酶及甲酸脫氫酶分別在大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，比較兩種雙酶耦聯(lián)體系 (S)-CHBE的生產(chǎn)能力，最終，KaCR1/甲酸脫氫酶共表達(dá)體系的產(chǎn)量為19.0 g/L，而共表達(dá)葡萄糖脫氫酶的產(chǎn)量達(dá)到45.6 g/L。雖然以甲酸脫氫酶進(jìn)行輔酶再生的效率低于葡萄糖脫氫酶，但是甲酸廉價(jià)易得，其產(chǎn)物CO2不會對羰基還原酶活力造成抑制，同時(shí)容易從體系中除去，因而具有一定的應(yīng)用前景。另外，也有學(xué)者利用畢赤酵母作為宿主生產(chǎn)(S)-CHBE，但僅能轉(zhuǎn)化350 mM底物。An等[17]利用基因組數(shù)據(jù)挖掘方法從C.albicans中獲得羰基還原酶CaCR，并與葡萄糖脫氫酶在E.coli Rosetta(DE3)中進(jìn)行共表達(dá)，經(jīng)過優(yōu)化后，24 g DCW/L細(xì)胞經(jīng)過25 h可將4.8 M COBE完全轉(zhuǎn)化，摩爾產(chǎn)率93.8%，e.e.＞99%，同時(shí)不需要額外添加輔酶，這是報(bào)道產(chǎn)量最高的雙酶耦聯(lián)型輔酶再生系統(tǒng)，具有很好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

3.2 底物耦聯(lián)型輔酶再生系統(tǒng)

2006 年，Inoue等[19]將從 Leifsonia sp.S749 中得到的醇脫氫酶LSADH用于 (S)-CHBE的合成。LSADH為NADH輔酶依賴型，可以將多種潛手性酮及酮酸酯還原成相應(yīng)的R型醇，并且可以利用異丙醇、2-丁醇、環(huán)戊醇等烷基醇實(shí)現(xiàn)自身輔酶循環(huán)。當(dāng)以異丙醇進(jìn)行NADH原位再生時(shí)，(S)-CHBE的積累濃度超過350 g/L，且e.e.＞99%。

2011年，Wang等[14]利用基因組挖掘技術(shù)從S.coelicolor中克隆到一種NADH依賴型的羰基還原酶ScCR，分子量約為26 kDa。ScCR具有廣泛的底物譜，能夠催化多種潛手性芳基酮、α-及β-酮酯，其中對于β-酮酯具有很高的立體選擇性，e.e.＞99%。該酶在催化COBE還原的同時(shí)，還可以催化異丙醇的氧化，從而實(shí)現(xiàn)輔酶再生。在甲苯/水兩相體系中，ScCR可以完全催化600 g/L(3.6 M)COBE生成(S)-CHBE，產(chǎn)率達(dá)到93%，e.e.＞99%。這也是目前文獻(xiàn)報(bào)道中底物耦聯(lián)型輔酶再生系統(tǒng)最高的底物濃度，具有不錯(cuò)的工業(yè)化前景。

Cai等[20]從C.albicans中篩選到的一種NADPH依賴的山梨糖還原酶SOU1，屬于SDR超家族，其最適pH為6.2，溫度為30℃。SOU1具有山梨醇脫氫酶活性，可以將山梨醇、甘露醇及木糖醇氧化成相應(yīng)的糖，同時(shí)，SOU1可以將COBE不對稱還原成(S)-CHBE，e.e.值達(dá)到99.6%。當(dāng)山梨醇：COBE為2:1時(shí)，在不額外添加輔酶的條件下可將2.5 M的COBE還原生成2.34 M(S)-CHBE，相較于雙酶耦聯(lián)系統(tǒng)，底物耦聯(lián)系統(tǒng)不需要調(diào)節(jié)pH，簡化了生產(chǎn)工藝。

4 總結(jié)與展望

統(tǒng)計(jì)顯示，他汀類藥物在降血脂藥物市場中所占份額達(dá)到90%以上，而阿托伐他汀控制了兩成的他汀類藥物市場份額。與此同時(shí)，阿托伐他汀在國內(nèi)需求也呈現(xiàn)持續(xù)上漲趨勢，未來市場前景廣闊。另外，阿托伐他汀專利的到期也為市場發(fā)展注入強(qiáng)勁動力。當(dāng)前，利用羰基還原酶進(jìn)行阿托伐他汀手性側(cè)鏈中間體 (S)-CHBE的合成已成為研究熱點(diǎn)，并取得了矚目成果。然而，(S)-CHBE酶法生產(chǎn)工藝仍有不足之處，例如時(shí)空產(chǎn)率有待提高，多數(shù)反應(yīng)依賴外源輔酶，有機(jī)溶劑及底(產(chǎn))物對酶造成損傷等。而基因挖掘技術(shù)、分子改造技術(shù)及生物反應(yīng)工程技術(shù)在 (S)-CHBE生產(chǎn)中的應(yīng)用，使得新型羰基還原酶的開發(fā)及改造變得更為便利，也必將為酶法催化合成(S)-CHBE開辟新的前景。

表1 產(chǎn)(S)-CHBE的羰基還原酶[6,8-17]

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