苦苣多酚超聲輔助提取及抗氧化研究

金寒冰 方 麗 賴蓓蕾 吳祥庭

（溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325027）

苦苣為草本植物，系菊科，苦苣菜屬，在中國分布廣泛，資源豐富［1］?？嘬氖菭I養(yǎng)豐富的中藥材，可全株入藥，味苦、性寒，可用于治療急性痢疾、腸炎、痔瘡腫痛等癥狀［2］。苦苣提取物具有明顯的抗炎、抗凝血作用、抗氧化性和抗腫瘤的作用［3］；苦苣的多酚類化合物的含量也是相當(dāng)豐富［4］。目前國內(nèi)外苦苣多酚提取工藝及抗氧化活性未見報道。本研究擬在傳統(tǒng)的回流浸提基礎(chǔ)上，加以超聲波輔助提取以提高多酚的提取率，通過單因素和二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合法優(yōu)化提取苦苣中多酚的工藝條件，再對苦苣多酚提取液進(jìn)行抗氧化活性的測定，為開發(fā)利用苦苣資源和生產(chǎn)多酚制品提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

苦苣：干品（水分＜0.5%），購于溫州農(nóng)貿(mào)市場，粉碎后過50目篩，得到苦苣粉末備用；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：分析純，美國Sigma公司；

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：分析純，上海阿拉丁試劑有限公司；

2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）：分析純，上海阿拉丁試劑有限公司；

乙醇、三氯甲烷、冰乙酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧水和三氯乙酸：分析純，無錫市佳妮化工有限公司；

VC：分析純，西隴化工股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

數(shù)顯水浴鍋：HH-S型，鞏義市英峪予華儀器廠；

數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器：SZCL-2B型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

微電腦智能化控制恒溫干燥箱：101-2型，寧波萊?？萍加邢薰?；

臺式低速離心機(jī)：80-2型，上海醫(yī)療器械有限公司；可見分光光度計：UV-722型，上海欣茂儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵：SHZ-Ⅲ型，上海亞榮生化儀器廠；

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：JY92-ⅡDN型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試劑的配制

（1）沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液配制：精確稱取0.070g的干燥沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解，定容于100mL的容量瓶中，配成濃度為700mg/L的沒食子酸溶液。

（2）福林（Folin-Ciocalteu）試劑的配制：在250mL磨口回流瓶中加入20g鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O），5g鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）及140mL蒸餾水，再加10mL 85%磷酸，20mL濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10h?；亓鹘Y(jié)束時，加入30g硫酸鋰（Li2SO4），10mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15min，以便去除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色，稀釋至1L，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。

（3）0.01mmol/L DPPH·溶液的配制：精確稱取0.198 4g DPPH·用無水乙醇溶解，定容于50mL容量瓶，搖勻，作為儲備液保存于冰箱中。

（4）0.02mg/mL BHT溶液配制：精確稱取0.5g BHT固體，用甲醇溶解，定容至50mL后從中取出1mL再用甲醇定容至50mL棕色容量瓶中。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液定容于50mL容量瓶內(nèi)，配成濃度為0～56mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。再從各標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取1mL加入25mL容量瓶內(nèi)，加10mL蒸餾水，搖勻，再加1.5mL Folin-Ciocalteu試劑，充分搖勻30s后，加入6mL 10%Na2CO3溶液，混勻后加水定容，再混勻，然后在3 0℃下避光放置反應(yīng)2h，以0樣為空白，在765nm的波長處測定吸光值，以吸光度值為縱坐標(biāo)A，濃度為橫坐標(biāo)C，繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程A＝0.114 1C＋0.003 9，相關(guān)系數(shù)R2＝0.995 2。

1.2.3 苦苣多酚提取 精密稱取1.000g干燥的苦苣粉末，置于250mL蒸餾瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的浸提溶劑搖勻，在不同超聲波功率和超聲時間下進(jìn)行處理，設(shè)定最高溫度為60℃，取出后在水浴鍋中于不同溫度下回流浸提一定時間，冷卻后用布氏漏斗過濾，收集濾液定容至50mL容量瓶中。

1.2.4 提取率的計算 取1mL苦苣多酚提取稀釋液于2 5mL容量瓶內(nèi)，加10mL蒸餾水，搖勻，再加1.5mL Folin-Ciocalteu試劑，搖勻，在放置30s后加入6mL 10%Na2CO3溶液，450s內(nèi)加完，混勻，加水定容，再混勻，避光反應(yīng)2h，在765nm波長處測定吸光值，根據(jù)測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線方程計算苦苣提取液中多酚含量（以沒食子酸計），計算得多酚提取率［5］。

式中：

Y——苦苣多酚提取率，%；

C——提取原液中多酚的濃度，mg/mL；

V——提取多酚稀釋液總體積，mL；

M——苦苣質(zhì)量，mg。

1.2.5 苦苣多酚提取單因素試驗

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響：稱取1g苦苣粉5份，在液固比25∶1（V∶m），即分別加入25mL體積分?jǐn)?shù)為40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液中搖勻，在超聲功率2 05W下超聲20min，再于65℃下浸提1 20min，并測定苦苣多酚提取率。

（2）液固比的影響：稱取1g苦苣粉5份，分別加入液固比為15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1（V∶m）體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液搖勻，在超聲功率2 05W下超聲2 0min，再于65℃下浸提120min，并測定苦苣多酚提取率。

（3）超聲功率的影響：稱取1g苦苣粉5份，加入液固比為30∶1（V∶m）體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，搖勻，分別在超聲功率105，155，205，255，305W 下超聲2 0min，再于6 5℃下浸提120min，并測定苦苣多酚提取率。

（4）超聲時間的影響：稱取1g苦苣粉5份，加入液固比為30∶1（V∶m）體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，搖勻，在超聲功率255W 下分別超聲10，15，20，25，3 0min，再于6 5℃下浸提120min，并測定苦苣多酚提取率。

（5）浸提溫度的影響：稱取1g苦苣粉5份，在液固比為30∶1（V∶m）體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液中搖勻，在超聲功率255W 下超聲20min，再分別于45，55，65，75，85℃下浸提120min，并測定苦苣多酚提取率。

（6）浸提時間的影響：稱取1g苦苣粉5份，在液固比為30∶1（V∶m）體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液中搖勻，在超聲功率255W下超聲2 0min，再于75℃下分別浸提40，80，120，160，200min，并測定苦苣多酚提取率。

1.2.6 苦苣多酚還原能力試驗 在10mL離心管內(nèi)加入2.5mL不同濃度苦苣多酚溶液（0.03，0.06，0.09，0.12，0.15，0.18mg/mL）與2.5mL 0.2mol/L 磷酸鈉緩沖液（p H 6.6）和2.5mL 1%鐵氰化鉀，混合，50 ℃水浴保溫2 0min后加入2.5mL 10%三氯乙酸（m/V），加蓋混勻，將混和物在3 000r/min條件下離心10min，移取5.0mL上清液于試管中，再加5.0mL去離子水和1mL 0.1%三氯化鐵，混合搖勻，靜置10min后用分光光度計在波長700nm處測吸光度，其吸光度的大小即反映了其還原能力的強(qiáng)弱［6，7］，用Vc作比較。每種濃度均做3次平行試驗。

1.2.7 苦苣多酚清除DPPH能力試驗 分別取濃度為0.03，0.06，0.09，0.12，0.15，0.18mg/mL的苦苣多酚溶液2.0mL，加入2.0mL用無水乙醇配制的0.8mmol/L DPPH溶液，用力振搖混勻后在黑暗環(huán)境中靜置3 0min，用UV-722型分光光度計于波長517nm處測定其吸光度，用Vc作比較［8］。計算DPPH清除率。

式中：

E——清除率，%；

Ax——加入樣品溶液后的吸光度；

Ax0——樣品溶液本底（樣品＋無水乙醇）的吸光度；

A0——空白對照液（DPPH溶液＋相應(yīng)溶劑）的吸光度。

1.2.8 苦苣多酚清除羥基自由基（·OH）能力試驗 芬頓（Fenton）體系鄰二氮菲－Fe2＋氧化法測定清除羥基自由基［9］，取1.5mL 1mmol/L 的鄰二氮菲分別放入試管中，加入4.5mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，再加入1mmol/L Fe-SO4溶液1mL，立即混勻后分別加入1mL 0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8mg/mL 的苦苣多酚液，然后加入1mL 0.1%H2O2，于37℃保溫60min，536nm處測定吸光度值，以相同濃度的Vc作對比試驗，按式（3）計算羥基自由基的清除率：

式中：

E——清除率，%；

Aa——加入樣品溶液后的吸光度；

Ab——水替代樣品和H2O2的吸光度；

A01——空白對照液（水替代樣品）的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對苦苣多酚類提取率的影響Figure 1 Effects of the solvent volume fraction on the extraction rate of Sonchus oleraceus L.phenolics

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對苦苣多酚提取率的影響 由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時，苦苣多酚的提取率最高為0.932%。乙醇濃度增加會使多酚的溶出增加，由于多酚含有酚羥基與蛋白質(zhì)、多糖等以氫鍵形成穩(wěn)定化合物，而乙醇的羥基能競爭性地與蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合，使酚羥基與蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合的氫鍵斷裂，從而使多酚提取率提高［10］。

2.1.2 液固比對苦苣多酚提取率的影響 由圖2可知，當(dāng)液固比達(dá)到30∶1（V∶m）時，苦苣多酚的提取率最高為1.099%。當(dāng)溶劑增大時苦苣多酚溶出量增多，當(dāng)液固比達(dá)到30∶1（V∶m）后再增加溶劑的量苦苣多酚的提取率增加不多，此外液固比的增大使得乙醇用量過大而成本增加，并且增加濃縮負(fù)荷。

圖2 液固比對苦苣多酚提取率的影響Figure 2 Effects of the ratio of liquid to solid on the extraction rate of Sonchus oleraceus L.phenolics

2.1.3 超聲功率對苦苣多酚提取率的影響 由圖3可知，當(dāng)超聲波功率達(dá)到255W時，苦苣多酚的提取率最高為0.851%。過低的超聲波功率不能打破多酚與蛋白質(zhì)多糖等的結(jié)合，使多酚不能很好地溶出，過高同樣會破壞多酚物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使提取率降低。

2.1.4 超聲時間對苦苣多酚提取率的影響 由圖4可知，當(dāng)超聲波時間達(dá)到20min時，苦苣多酚的提取率最高為0.924%。超聲波輔助提取有利于苦苣細(xì)胞更好的破碎使得細(xì)胞內(nèi)多酚類化合物得以溶出，達(dá)到一定的破碎度才能有很好的提取率，當(dāng)超聲波時間過長時，多酚易氧化分解［11］，導(dǎo)致苦苣多酚的提取率反而降低。

2.1.5 浸提溫度對苦苣多酚提取率的影響 由圖5可知，當(dāng)浸提溫度達(dá)到75℃時，苦苣多酚的提取率最高為0.885%。在溫度較低時，隨著溫度的升高，多酚類化合物在醇液中的運動速度增大，促進(jìn)其從細(xì)胞中溶出，提高提取效果，而當(dāng)溫度超過75℃時，過高的浸提溫度會破壞多酚的結(jié)構(gòu)，再加上多酚在高溫環(huán)境下容易發(fā)生氧化。

圖3 超聲功率對苦苣多酚提取率的影響Figure 3 Effects of the ultrasonic power on the extraction rate of Sonchus oleraceus L.phenolics

2.1.6 浸提時間對苦苣多酚提取率的影響 由圖6可知，當(dāng)浸提時間達(dá)到120min時，苦苣多酚的提取率最高為0.887%。提取時間太短，苦苣與提取液之間接觸不夠充分，苦苣細(xì)胞中多酚的溶出不完全；浸提時間過長，長時間的受熱會使得部分多酚類化合物的結(jié)構(gòu)遭到破壞，影響苦苣多酚提取率。

綜上單因素試驗選擇最佳條件進(jìn)行驗證實驗，在70%乙醇體積分?jǐn)?shù)，液固比30∶1（V∶m），超聲功率255W，超聲時間20min，再浸提溫度75℃，浸提時間2h，重復(fù)實驗3次，苦苣多酚的提取率（1.040±0.09）%。

圖4 超聲時間對苦苣多酚提取率的影響Figure 4 Effects of the ultrasonic time on the extraction rate of Sonchus oleraceus L.phenolics

圖5 浸提溫度對苦苣多酚提取率的影響Figure 5 Effects of the extraction temperature on the extraction rate of Sonchus oleraceus L.phenolics

圖6 浸提時間對苦苣多酚提取率的影響Figure 6 Effects of the extraction time on the extraction rate of Sonchus oleraceus L.Phenolics

2.2 苦苣多酚抗氧化活性

2.2.1 苦苣多酚還原能力 由圖7可知，從一開始苦苣多酚的還原能力就要比VC強(qiáng)。隨著濃度的增大，苦苣多酚的還原能力增大但增大速度有所減慢。而VC的還原能力隨濃度的增加而增大的幅度仍舊較快，可見，苦苣多酚的還原能力強(qiáng)于Vc的還原能力。

圖7 不同濃度的苦苣多酚與Vc的還原能力比較Figure 7 Comparison of reducing power between different concentration polyphenol in Sonchus oleraceus and Vc

2.2.2 苦苣多酚清除DPPH能力 苦苣多酚和VC對DPPH清除效果見8。在試驗濃度范圍以內(nèi)，不同濃度的苦苣多酚對DPPH清除率隨濃度的提高而增大。當(dāng)濃度大于0.09mg/mL后，苦苣多酚和Vc的清除效果相當(dāng)，達(dá)到半數(shù)清除率，在0.18mg/mL苦苣多酚和Vc的清除率達(dá)到了80%以上，說明苦苣多酚與Vc對DPPH清除能力相當(dāng)，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2.2.3 苦苣多酚清除羥基自由基（·OH）能力 ·OH 是引起脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)和多糖分解的重要活性氧自由基，是體內(nèi)最活潑的活性氧。由圖9可知，苦苣多酚和Vc對·OH均有清除作用，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，在濃度為0.3～1.2mg/mL時苦苣多酚對·OH清除率能力較Vc稍差，當(dāng)濃度大于1.2mg/mL后，苦苣多酚和Vc的清除效果相當(dāng)，兩者在1.2～1.5mg/mL時達(dá)到半數(shù)清除率，在1.8mg/mL苦苣多酚和Vc的清除率達(dá)到了82%以上，說明苦苣多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，在較高濃度時與Vc清除羥基自由基能力相當(dāng)。

圖8 不同濃度的苦苣多酚與Vc對DPPH的清除效果Figure 8 Scavenging ability of different concentration polyphenol in Sonchus oleraceus and Vc on DPPH

圖9 不同濃度的苦苣多酚與Vc對羥基自由基（·OH）的清除效果Figure 9 Scavenging ability of different concentration polyphenol in Sonchus oleraceus and Vc on·OH

3 結(jié)論

（1）超聲輔助提取苦苣多酚不僅提取效率高、提取時間短，而且提取成本低。在70%乙醇體積分?jǐn)?shù)，液固比30∶1（V∶m），超聲功率255W，超聲時間20min后，再浸提溫度75℃，浸提時間2h的條件下，多酚提取率為（1.040±0.09）%。

（2）試驗結(jié)果表明，苦苣多酚的還原能力與其濃度成正相關(guān)性，在低于0.15mg/mL時還原力比 Vc弱，高于0.15mg/mL時還原力與Vc相當(dāng)；苦苣多酚對DPPH清除率隨濃度的提高而增大，當(dāng)濃度大于0.09mg/mL后，苦苣多酚和Vc的清除效果相當(dāng)，在0.18mg/mL苦苣多酚和Vc的清除率達(dá)到了80%以上；苦苣多酚和Vc對·OH均有清除作用，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，在濃度為0.3～1.2mg/mL時苦苣多酚對·OH清除率能力較Vc稍差，當(dāng)濃度大于1.2mg/mL后，苦苣多酚和Vc的清除效果相當(dāng)，兩者在1.2～1.5mg/mL時達(dá)到半數(shù)清除率，在1.8mg/mL苦苣多酚和Vc的清除率達(dá)到了82%以上。說明苦苣多酚具有比較強(qiáng)的抗氧化性，是天然的抗氧化劑。但本試驗只研究了苦苣多酚體外抗氧化的部分試驗，下一步將進(jìn)行動物試驗以探討其在生物體內(nèi)的清除自由基能力，對苦苣多酚的分子結(jié)構(gòu)也有待進(jìn)一步研究。

1 王躍強(qiáng).苦苣開發(fā)價值與栽培［J］.北方園藝，2008，3（1）：118～119.

2 王二霞，趙健，琚爭艷，等.苦菜及其研究開發(fā)現(xiàn)狀［J］.食品工業(yè)科技，2008，29（10）：272～274.

3 白玉華，于輝，常乃丹，等.日本苦苣的化學(xué)成分［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報.2008，39（3）：279～281.

4 林櫻姬，趙萍，王雅.植物多酚的提取方法和生物活性研究進(jìn)展［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，6（1）：105～107.

5 何志勇，夏文水.Folin-Ciocalteu比色法測定橄欖中多酚含量的研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2006，26（4）：15～18.

6 石恩慧，郭凱軍，李紅.板栗總苞多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報2013，25（2）：406～414.

7 Luo H，Lin S，Ren F，et al.Antioxidant and antimicrobial capacity of Chinese medicinal herb extracts in raw sheep meat［J］.Journal of Food Protection，2007，70（1）：1440–1445.

8 王進(jìn)英，鐘海雁，朱曉陽，等.多齒紅山茶籽多酚組分的抗氧活性研究［J］.食品與機(jī)械，2013，29（1）：105～107.

9 魏銀花，申迎賓，王立，等.紫米多酚提取工藝及抗氧化活性研究［J］.食品與機(jī)械，2013，29（3）：111～115.

10 張海暉，段玉清，倪燕，等.谷物中多酚類化合物提取方法及抗氧化效果研究［J］.中國食品學(xué)報，2008，23（6）：107～111.

11 Xi J，Shen D J，Zhao S，et al.Characterization of polyphenols from green tea leaves using a high hydrostatic pressure extraction［J］.International Journal of Pharmaceutics，2009，382（1）：139～143.