二維液相色譜在藥物和毒物分析中的應(yīng)用進展

蕭偉斌++蹇陽++李樺

摘 要 生物樣品中藥物、毒物及內(nèi)源性物質(zhì)的定性與定量分析在生命科學(xué)和藥物研發(fā)中發(fā)揮重要作用。生物樣品的基質(zhì)復(fù)雜，干擾物多，待測物濃度與內(nèi)源性物質(zhì)相比明顯偏低，且樣品取樣量少，因此要求生物分析方法的特異性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好。二維液相色譜技術(shù)具有峰容量大、顯著降低復(fù)雜樣品的基質(zhì)效應(yīng)和殘留現(xiàn)象，及可以實現(xiàn)樣品分析的自動化等特點，已成為生物樣品分離分析的有力工具，在環(huán)境、食品和藥物分析中得到廣泛應(yīng)用。本文在簡要介紹了二維液相色譜原理裝置基礎(chǔ)上，對其在生物樣品中藥物、毒物和內(nèi)源性物質(zhì)分析中的應(yīng)用進展進行了綜述。

1 引 言

藥物代謝和藥代動力學(xué)（DMPK）定量描繪藥物及其它外源性物質(zhì)經(jīng)過各種途徑進入機體后的吸收、分布、代謝、排泄過程及其機制，闡釋機體對藥物的處置、揭示藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化以及與內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的相互作用，為新藥研發(fā)和臨床安全、有效和合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。生物樣品中藥物及其代謝產(chǎn)物的定性與定量分析，是藥物代謝研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，復(fù)雜生物基質(zhì)中低濃度藥物和代謝產(chǎn)物的檢測、定量分析和結(jié)構(gòu)鑒定常是一個挑戰(zhàn)性工作[ 1]。同時，在疾病發(fā)現(xiàn)和診斷、藥物對機體的藥效學(xué)研究、臨床用藥監(jiān)測以及濫用藥物和毒物的中毒分析中，也涉及大量的體內(nèi)生物樣品的分析，其對象包括血漿、血清、尿、唾液、膽汁等各種體液，以及組織樣品和排泄物。藥代 動力學(xué)和其它生物分析的樣品基質(zhì)均較復(fù)雜，干擾物多（蛋白質(zhì)、脂肪、激素、神經(jīng)遞質(zhì)和尿素等代謝物等），取樣量少，待測物濃度與內(nèi)源性物質(zhì)相比明顯偏低，因此要求生物分析方法的特異性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好。藥代動力學(xué)研究和臨 床藥物監(jiān)測需要分析大量樣本，對分析的通量和方便簡便快速也有要求。目前，生物分析和藥代動力學(xué)研究首選色譜法，連接不同類型的檢測器（紫外、熒光、電化學(xué)、質(zhì)譜等）的液相色譜可以適應(yīng)不同類型化合物的檢測，應(yīng)用最為廣泛。在過去的十多年中，隨著質(zhì)譜接口技術(shù)的快速發(fā)展和分析靈敏度的提高，選擇性強、靈敏度高的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LCMS）已成為藥代動力學(xué)研究及其它藥物毒物生物分析的主導(dǎo)技術(shù)[ 2]，其中，液相色譜的分離功能對于復(fù)雜基質(zhì)或多組分樣品分析的靈敏度、重現(xiàn)性和準確性至關(guān)重要。二維液相色譜的出現(xiàn)，大大提高了分離效率，為這些樣品的分離測定提供了有力工具[ 3]。

血漿、尿、組織等生物樣品的成分復(fù)雜，在應(yīng)用LCMS及時進行定性與定量分析時，一般需要進行樣品的前處理，這是極為重要的環(huán)節(jié)，也常是最困難、最繁復(fù)的工作。前處理在復(fù)雜基質(zhì)樣品分析中是最為耗時的部分，其結(jié)果將直接影響定性與定量分析結(jié)果的可靠性。有人認為，約1/3的分析誤差是由繁瑣的前處理步驟產(chǎn)生的[ 4]，并占據(jù)了約2/3的工作量[ 5]?；诙S液相色譜的在線固相萃取技術(shù)，顯著簡化了樣品前處理工作，使得高通量的全自動樣品分析成為可能，在中藥有效成分分析、藥物質(zhì)量分析、食品安全、環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[ 6～9]。近年來，這一技術(shù)在藥物代謝和生物分析中得以應(yīng)用，并逐漸顯示優(yōu)勢。

2 在線二維色譜原理、裝置及特點

二維液相色譜是將分離機理不同而又相互獨立的兩支色譜柱串聯(lián)起來構(gòu)成的分離系統(tǒng)，通過柱切換技術(shù)完成樣品在二維色譜柱之間的流動。分析時，樣品經(jīng)過第一維色譜柱的分離，進入切換閥的接口中，經(jīng)捕集或切割后，被切換進入第二維色譜柱及檢測器。二維色譜按切割組分進入二維柱方式分為中心切割和全二維方式；又可根據(jù)切割組分是否直接進入二維柱中，分為離線與在線兩種類型。目前用于分析的二維液相色譜大多應(yīng)用在線方式，即一維洗脫產(chǎn)物全部或部分直接進入到二維色譜柱中進行分離分析。

在裝置方面，單泵系統(tǒng)與雙泵系統(tǒng)均能實現(xiàn)在線二維液相色譜分離[ 10]。雙泵系統(tǒng)可以采用臨時搭建的方式或者選用整合式色譜儀。圖1A所示的雙泵系統(tǒng)通常需要使用者額外添加一個泵、色譜柱和切換閥，以實現(xiàn)多條流路的切換。樣品首先通過一維泵將樣品裝載至一維色譜柱中進行洗脫分離，使用雙樣品環(huán)接口、停流模式或真空揮發(fā)的接口切換技術(shù)捕集洗脫產(chǎn)物，再用高濃度的二維泵流動相將保留在接口或一維柱上的分析物以正沖或者反沖模式從一維轉(zhuǎn)移到二維分析柱上繼續(xù)分離，由此能夠獲得更大的峰容量[ 11，12]。整合式色譜儀整合了二維色譜所需的雙泵、管路套裝與連接指導(dǎo)，例如UltiMate3000型液相色譜儀，通過軟件操作和獨特的閥切換技術(shù)（圖2），實現(xiàn)在線二維色譜的多種應(yīng)用[ 13，14]。應(yīng)用單泵系統(tǒng)，如圖1B所示，也可以實現(xiàn)二維色譜的操作[ 15，16]，輸液泵將樣品裝載至SPE柱中，并將不保留物質(zhì)沖洗至廢液中，之后關(guān)閉廢液位置，迫使梯度流動相經(jīng)SPE柱流向分析柱。

與傳統(tǒng)的液相色譜和離線固相萃取色譜分析相比，在線二維色譜的優(yōu)勢在于峰容量明顯提升、復(fù)雜樣品的基質(zhì)效應(yīng)和殘留現(xiàn)象顯著降低、以及自動化樣品前處理以提高分析的通量。在一維色譜模式下，如果峰數(shù)量超過了峰容量的37%，色譜峰分辨率將明顯下降，而二維色譜的峰容量是一維與二維色譜分離峰容量的乘積[ 17～19]，分離效率大大提高，因此可以用于多組分、復(fù)雜基質(zhì)樣品的分離分析。將二維色譜的其中一維配置固相萃取柱，可以完成自動固相萃取、脫鹽和除蛋白、以及低濃度分析物的富集，復(fù)雜基質(zhì)樣品可直接進樣，樣品的自動化前處理顯著改善了基質(zhì)效應(yīng)和殘留現(xiàn)象，提高分析的靈敏度和重現(xiàn)性，滿足大批量樣品的全自動和高通量分析要求。除此之外，由于整個分析過程在密閉系統(tǒng)中進行，可以減少樣品污染及可能發(fā)生的分析物降解[ 9，20，21]。

利用在線固相萃取液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定人血漿中的8OHdG含量，方法不僅省時省力，還可避免電化學(xué)檢測法中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾和免疫檢測特異性低的問題，方法可用于評價疾病狀態(tài)以及人體接觸納米顆粒后的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

人體前列腺素E2（PGE2）由前列腺素E2合成酶1合成，在炎癥反應(yīng)、疼痛、發(fā)燒和血管調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。Fabian等[ 50]通過測定A549微粒體孵育體系中前列腺素E2含量，篩選微粒體前列腺素E2合成酶1（mPGES 1）抑制劑。他們建立了在線固相萃取HPLCUV方法，分別設(shè)計了單SPE柱和并聯(lián)SPE柱交替模式，并進行比較。結(jié)果證明，在線固相萃取法不需要任何前處理，靈敏度達到57 μg/L；與單柱相比，并聯(lián)雙柱模式分析時間顯著縮短，為mPGES 1抑制劑的篩選提供了快速可靠的方法。同樣，Heinig等建立在線萃取技術(shù)，以小鼠血漿、尿液和組織中糖皮質(zhì)激素濃度水平作為生物標志物，進行11βHSD1抑制劑候選藥的藥效評價[ 51]。

內(nèi)源性腦神經(jīng)肽是重要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑，由于其含量較低和大腦組織基質(zhì)的復(fù)雜性，使得定量測定很困難。一維液相色譜在測定腦神經(jīng)肽時難以獲得足夠的分離度。Mihailova等[ 52]建立了兩套在線二維液相色譜系統(tǒng)，即HILICRP和SCXRP色譜系統(tǒng)，通過比較確定適用于缺氧應(yīng)激條件下大腦神經(jīng)肽含量測定方法。實驗結(jié)果顯示，HILICRP系統(tǒng)可在一維柱分離后得到19個肽段，而傳統(tǒng)的SCXRP系統(tǒng)的實際局限性僅得到6個，HILICRP系統(tǒng)比SCXRP系統(tǒng)獲得多于3倍的肽段信息，表明HILICRP系統(tǒng)更適合腦神經(jīng)肽的肽段組學(xué)比較研究。同時，為了防止HILIC和RP柱不兼容的問題，在兩柱間再加了一根SPE柱，使得流動相間的切換能夠平穩(wěn)過渡。

3.6 手性化合物的分離和分析

在藥物研究中，常常需要對樣品中不同藥物或藥物手性異構(gòu)體進行分離，二維液相色譜是手性化合物分離的有力工具之一。Mangani等[ 20]建立了多柱在線切換HPLC技術(shù)對血清中常用的6種治療心血管疾病藥物進行分離測定，其中β受體阻斷劑吲哚洛爾是手性藥物。血清樣品先經(jīng)過在線SPE進行純化， 純化樣品洗脫進入RP18柱，用pH 2.5的流動相洗脫，將吲哚洛爾與其它藥物完全分離，后 者經(jīng) UV檢測；隨后通過中心切割，將吲哚洛爾引入手性AGP柱以pH 7.0的流動相進行二維手性分離分析。通過對流動相pH的調(diào)整，同一二維色譜法也可應(yīng)用于其他藥物及其代謝產(chǎn)物的分離。Bester等[ 53]則應(yīng)用在線二維液相色譜法分離檢測生物樣品（魚油、灰歐肝等）中的六溴環(huán)十二烷（HBCD）。市場上HBCD是3種異構(gòu)體 （αHBCD， βHBCD和γHBCD）的混合物，且每種異構(gòu)體還存在手性異構(gòu)，盡管通過手性柱可以手性分離異構(gòu)體，但3種異構(gòu)體間的完全分離非常困難。Bester等[53]的方法分別用Synergi polar plus柱和Nucleodex betaPM柱作為一維和二維柱，待測物先在一維柱上使異構(gòu)體達到分離，再通過中心切割進入二維柱實現(xiàn)各手性異構(gòu)體的分離。與以往的單柱或是串聯(lián)柱方法相比，該方法的分析物色譜峰不受其它異構(gòu)體峰或雜質(zhì)峰影響，有效峰容量提高了2倍，各異構(gòu)體在二維色譜上達到更充分的分離。

4 展 望

經(jīng)過十余年的快速發(fā)展，無論在儀器設(shè)備、技術(shù)上、還是在應(yīng)用擴展方面，二維液相色譜均有顯著進步。在原有液相色譜的基礎(chǔ)上增加簡單配置，如添加一個泵和六通閥，實現(xiàn)在線二維液相色譜。色譜儀器廠家也已開發(fā)出了多種整合式的在線二維液相色譜系統(tǒng)，如UltiMate 3000型液相色譜儀、RapidFireTM SPEMS系統(tǒng)等。目前，二維液相色譜多采用在線模式與質(zhì)譜相連，成功應(yīng)用于各種復(fù)雜基質(zhì)樣品中的小分子藥物和大分子蛋白等的分析。本文總結(jié)了近幾年在線二維液相色譜在藥物代謝領(lǐng)域， 以及體內(nèi)藥物、毒物和內(nèi)源物生物分析方面的應(yīng)用進展。大量應(yīng)用實例展示了在線二維液相色譜在復(fù)雜生物樣品中藥物、毒物和內(nèi)源物分析中的優(yōu)勢，為生物分析中常見的基質(zhì)干擾、前處理方法繁瑣、通量低、重現(xiàn)性和準確性較差等問題提供了有效的解決方案，近年來在藥代動力學(xué)研究及其它生物樣品的分析中得以廣泛應(yīng)用。

但是，二維液相色譜的應(yīng)用推廣還有一些問題需要進一步解決。 例如，二維色譜柱系統(tǒng)選擇和方法建立， 以及流動相的選擇和匹配相對復(fù)雜，需要繁瑣的軟件設(shè)置和支持，對專業(yè)知識和技能有一定的要求；因兼容性問題，進入二維柱的樣品常需要稀釋，導(dǎo)致方法靈敏度降低，影響生物樣品中痕量化合物的檢測；以及固相萃取柱和色譜柱的選擇性和可用性的限制等。隨著二維液相色譜的不斷發(fā)展完善，以及應(yīng)用面的擴大和經(jīng)驗的積累和總結(jié)，這一技術(shù)在體內(nèi)藥物、毒物和內(nèi)源性物質(zhì)分析中將具有 良好的應(yīng)用前景。

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Application of Twodimensional Liquid Chromatography

Analysis of Drugs and Toxicants

XIAO WeiBin， JIAN Yang， LI Hua*

（Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology， State Key Laboratory of Toxicology and

Medical Countermeasures， Beijing 100850，China）

Abstract Qualitative and quantitative analyses of biological samples containing drugs， toxicants and endogenous substances play an important role in the researches of life sciences， as well as in new drug discovery and development. Biological samples are characterized by complex matrix， multiple endogenous interferences， significantly lower concentrations of measured analytes compared to endogenous components and small sampling volume. Consequently， it often requires bioanalysis methods with superior specificity， high sensitivity and good reproducibility. The twodimensional liquid chromatography （2DLC） technique， which allows for high peak capacity， significant reduced matrix effect and carryover of complex matrix samples and automated sample pretreatment and analysis， has been the powerful solution to the separation and analysis of biological sample and widely applied to environment， food and pharmaceutical analysis. On the basis of introduction of the principle and equipments of 2DLC， the application of this technique in the pharmacokinetics， toxicological and biological study was reviewed.

Keywords Two dimensional liquid chromatography； Online solid phase extraction； Pharmacokinetics； Bioanalysis； Review

（Received 31 August 2014； accepted 20 October 2014）

（Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology， State Key Laboratory of Toxicology and

Medical Countermeasures， Beijing 100850，China）

Abstract Qualitative and quantitative analyses of biological samples containing drugs， toxicants and endogenous substances play an important role in the researches of life sciences， as well as in new drug discovery and development. Biological samples are characterized by complex matrix， multiple endogenous interferences， significantly lower concentrations of measured analytes compared to endogenous components and small sampling volume. Consequently， it often requires bioanalysis methods with superior specificity， high sensitivity and good reproducibility. The twodimensional liquid chromatography （2DLC） technique， which allows for high peak capacity， significant reduced matrix effect and carryover of complex matrix samples and automated sample pretreatment and analysis， has been the powerful solution to the separation and analysis of biological sample and widely applied to environment， food and pharmaceutical analysis. On the basis of introduction of the principle and equipments of 2DLC， the application of this technique in the pharmacokinetics， toxicological and biological study was reviewed.

Keywords Two dimensional liquid chromatography； Online solid phase extraction； Pharmacokinetics； Bioanalysis； Review

（Received 31 August 2014； accepted 20 October 2014）

（Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology， State Key Laboratory of Toxicology and

Medical Countermeasures， Beijing 100850，China）

Abstract Qualitative and quantitative analyses of biological samples containing drugs， toxicants and endogenous substances play an important role in the researches of life sciences， as well as in new drug discovery and development. Biological samples are characterized by complex matrix， multiple endogenous interferences， significantly lower concentrations of measured analytes compared to endogenous components and small sampling volume. Consequently， it often requires bioanalysis methods with superior specificity， high sensitivity and good reproducibility. The twodimensional liquid chromatography （2DLC） technique， which allows for high peak capacity， significant reduced matrix effect and carryover of complex matrix samples and automated sample pretreatment and analysis， has been the powerful solution to the separation and analysis of biological sample and widely applied to environment， food and pharmaceutical analysis. On the basis of introduction of the principle and equipments of 2DLC， the application of this technique in the pharmacokinetics， toxicological and biological study was reviewed.

Keywords Two dimensional liquid chromatography； Online solid phase extraction； Pharmacokinetics； Bioanalysis； Review

（Received 31 August 2014； accepted 20 October 2014）