大腸桿菌代謝工程生產(chǎn)芳香族化合物研究進(jìn)展*

李飛飛，趙廣榮

(天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，天津，300072)

芳香族化合物廣泛應(yīng)用于化工、飼料、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，其主要的來(lái)源是石油和煤焦油工業(yè)，化學(xué)合成是工業(yè)上生產(chǎn)芳香類化合物普遍采用的方法。芳香族化合物也廣泛分布于自然界，是各種生物的初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物，所以也有一部分芳香族產(chǎn)品是通過(guò)生物法獲得的。近年來(lái)，隨著環(huán)保要求的提高和化石能源的減少，利用生物法合成芳香族目標(biāo)化合物成為研究的熱點(diǎn)，其中微生物發(fā)酵法是通過(guò)優(yōu)良的微生物菌種在合適的條件下以葡萄糖、甘油等可再生原料發(fā)酵積累芳香族化合物。目前對(duì)于微生物中芳香族化合物的合成途徑和調(diào)控機(jī)理研究最多且闡述最為清楚的是大腸桿菌。

大腸桿菌體內(nèi)芳香族化合物的合成主要通過(guò)莽草酸途徑(shikimate pathway)(圖1)和其下游芳香族氨基酸進(jìn)一步衍生化實(shí)現(xiàn)。由于大腸桿菌自身積累芳香族化合物能力很低，只有代謝途徑優(yōu)化改造才能更好的實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)。近幾年通過(guò)大腸桿菌代謝工程方法生產(chǎn)芳香族化合物取得了顯著成效，極大地提高了目標(biāo)化合物的合成積累能力，這為日后研究的進(jìn)一步深入和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 莽草酸途徑及莽草酸生物合成

如圖1所示，莽草酸途徑是所有芳香族化合物合成共有的，合成的起始物是赤蘚糖-4-磷酸(E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHP合成酶)催化下生成DAHP，后其經(jīng)過(guò)3步酶催化形成莽草酸(shikimate)，途徑終產(chǎn)物為分支酸(chorismic acid，CHA)，以分支酸為前體分別合成L-酪氨酸和L-苯丙氨酸，及L-色氨酸。3種芳香氨基酸可經(jīng)不同酶催化得到多種的芳香族衍生物。莽草酸途徑是下游芳香族化合物合成的前提，其代謝通路是否暢通直接影響到下游目標(biāo)化合物的產(chǎn)量。對(duì)于途徑的改造多集中于增加來(lái)自于糖酵解途徑(glycolytic pathway)PEP和磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)E4P前體的供應(yīng)，DAHP合成同工酶基因突變以抗反饋抑制，途徑中負(fù)調(diào)控基因的敲除和競(jìng)爭(zhēng)途徑的阻斷，以及途徑中的關(guān)鍵酶的過(guò)表達(dá)等［1］。

莽草酸是生產(chǎn)抗病毒藥物達(dá)菲重要的原料，目前主要從植物中提取獲得。Gosset等［2］通過(guò)在缺失磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Phosphotransferase system，PTS)和丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，Pyk)的大腸桿菌體內(nèi)過(guò)表達(dá)戊糖磷酸途徑和莽草酸途徑的6個(gè)基因，以葡萄糖為碳源培養(yǎng)基分批補(bǔ)料發(fā)酵30 h，莽草酸產(chǎn)量達(dá)到43 g/L。Escalante 等［3］利用缺失 PTS、aroK、aroL、pykF或pykA及 過(guò)表達(dá)aroG、tktA、aroB和aroE的大腸桿菌生產(chǎn) SA，產(chǎn)量達(dá)7 g/L，產(chǎn)率達(dá)0．29 mol/mol。Zhou 等［4］利用過(guò)表達(dá) tktA、glk、aroE 和 aroB 基因，并敲除aroK、aroL、ptsHIcrr和ydiB基因的大腸桿菌，10 L發(fā)酵罐發(fā)酵，SA積累產(chǎn)量達(dá)到1 850 mg/L。

2 L-酪氨酸衍生物大腸桿菌代謝工程合成

由莽草酸途徑終產(chǎn)物分支酸出發(fā)，經(jīng)過(guò)分支酸變位酶(Chorimate mutase)TyrA和PheA催化，得到預(yù)苯酸(prephenic acid，PA)，預(yù)苯酸在預(yù)苯酸脫氫酶(prephenate dehydrogenase)作用下得到4-羥基苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvate)，4-羥基苯丙酮酸在 L-酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Tyrosine aminotransferase)TyrB或AspC作用下通過(guò)與L-谷氨酸的轉(zhuǎn)氨作用生成L-酪氨酸。L-酪氨酸是人和動(dòng)物新陳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育重要的、必需的氨基酸。通過(guò)代謝工程構(gòu)建高產(chǎn)L-酪氨酸的工程大腸桿菌，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-酪氨酸成為近幾年的熱點(diǎn)［1］。

圖1 芳香氨基酸生物合成途徑Fig．1 Biosynthesis pathway of aromatic amino acid

L-酪氨酸作為很好的平臺(tái)化合物，以其為前體利用大腸桿菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化可以得到多種廣泛用途的化學(xué)品，如圖2所示，其衍生物包括對(duì)羥基苯乳酸、對(duì)羥基苯乙酸、對(duì)羥基苯乙醇、L-多巴、丹參素、黑色素、咖啡酸、對(duì)羥基肉桂酸、對(duì)羥基苯乙烯，苯酚，對(duì)羥基苯甲酸等。

圖2 通過(guò)大腸桿菌代謝工程合成L-酪氨酸相關(guān)衍生物Fig．2 L-tyrosine derivatives synthesized by metabolic engineering of Escherichial coli

4-羥基苯乳酸(4-hydroxyphenyllactic acid，HPL)是合成新型糖尿病藥物和混雜多肽的關(guān)鍵中間體，4-羥基苯乙酸(4-hydroxyphenylacetic acid，HPA)可用于合成β-受體阻滯藥阿替洛爾和葛根黃豆甙元有效成分4，7-二羥基異黃酮的合成，4-羥基苯乙醇(4-hydroxyphenethylalcohol，HPAL)可用于合成心血管藥物美多心安。Sakai等［5］將來(lái)自 Cupriavidus necator的乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase)基因整合到L-酪氨酸高產(chǎn)菌株染色體上表達(dá)，得到4-羥基苯乳酸;將來(lái)自Azospirillum brasilense的苯丙酮酸脫羧酶(Phenylpyruvate decarboxylase)基因ipdC和Escherichial coli的苯乙醛脫氫酶(Phenylacetaldehyde dehydrogenase)基因feaB整合到L-酪氨酸高產(chǎn)菌株染色體上表達(dá)，得到4-羥基苯乙酸;將ipdC和來(lái)自Lactobacillus brevis的乙醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase)基因整合到染色體上表達(dá)，得到產(chǎn)4-羥基苯乙醇。

多巴(L-3，4-dihydroxyphenylalanine ，L-DOPA)是一種治療帕金森癥的芳香族化合物。Gosset等［6］表達(dá)來(lái)自于Escherichial coli的抗反饋抑制DAHP合成酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、分支酸變位酶和來(lái)自于 Zymomonas mobilis的環(huán)己二烯脫氫酶(Cyclohexadienyl dehydrogenase)得到高產(chǎn)L-酪氨酸菌株，進(jìn)一步表達(dá)大腸桿菌4-羥基苯乙酸3-羥化酶(4-Hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，HpaBC)實(shí)現(xiàn) L-酪氨酸向 L-多巴轉(zhuǎn)化，發(fā)酵50 h時(shí)L-多巴產(chǎn)量達(dá)到1．51 g/L。

丹參素(salvianic acid A，SAA)是一種酚酸類化合物，可用于胸憋悶、心絞痛治療等，其主要來(lái)源是藥用植物丹參中提取。YAO等［7］通過(guò)模塊化代謝工程雙啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)L-酪氨酸合成途徑中6個(gè)關(guān)鍵基因得到高產(chǎn)L-酪氨酸大腸桿菌，并在此基礎(chǔ)上引入D-乳酸脫氫酶(D-lactate dehydrogenase)和4-羥基苯乙酸3-羥化酶，實(shí)現(xiàn)丹參素的合成，產(chǎn)量達(dá)到7．1 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到 0．47 mol/mol。

黑色素(melanin)是動(dòng)物皮膚或毛發(fā)中存在的一種黑褐色的色素，可以保護(hù)機(jī)體避免受紫外線的傷害，其合成主要通過(guò)酪氨酸酶(Tyrosinase)對(duì)L-酪氨酸的轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)，Gosset等［8］缺失PTS系統(tǒng)和tyrR基因，同時(shí)表達(dá)編碼來(lái)自Rhizobium etli的酪氨酸酶的melA基因，大腸桿菌以葡萄糖為碳源發(fā)酵120 h黑色素產(chǎn)量達(dá)到3．22 g/L。

咖啡酸(caffeate)具有收縮增固微血管、提高凝血因子、升高白細(xì)胞和血小板的作用，同時(shí)它還具有抗炎和抗腫瘤的作用，是醫(yī)藥的重要原料和中間體。Stephanolpoulos等［9］通過(guò)優(yōu)化不同的途徑、基因拷貝數(shù)、培養(yǎng)基等條件，從L-酪氨酸合成咖啡酸，產(chǎn)量達(dá)106 mg/L。YAN Yajun 等［10］在高產(chǎn) L-酪氨酸大腸桿菌中表達(dá)4-羥基苯乙酸3-羥化酶并優(yōu)化接種時(shí)間，發(fā)酵咖啡酸產(chǎn)量達(dá)到766．68 mg/L。

4-羥基苯乙烯(4-hydrostyrene)可用作高性能聚合物材料光刻膠單體。Sariaslani等［11］利用1株表達(dá)來(lái)自Rhodotorula glutinis L-酪氨酸氨解酶(Tyrosine ammonia-lyase)和來(lái)自Lactobacillus plantarum對(duì)香豆酸脫氫酶(4-coumaric acid decarboxylase)大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)L-酪氨酸經(jīng)對(duì)香豆酸(4-coumalic acid，4CA)向4-羥基苯乙烯轉(zhuǎn)化，在14L發(fā)酵罐磷酸鹽限制型碳源培養(yǎng)基發(fā)酵，4-羥基苯乙烯產(chǎn)量達(dá)到0．4 g/L。

圖3 由大腸桿菌代謝工程合成的L-苯丙氨酸(a)和L-色氨酸(b)相關(guān)衍生物Fig．3 Derivatives of L-phe(a)and L-try(b)synthesized by metabolic engineering of Escherichial coli

苯酚(phenol)是重要的有機(jī)化工原料，在樹脂、合成纖維、合成橡膠、殺菌劑、防腐劑、染料以及醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域有著重要用途，醫(yī)療上也用于外科器械或皮膚的殺菌消毒。Lee等［12］在大腸桿菌中利用SRNA技術(shù)抑制負(fù)調(diào)控基因，過(guò)表達(dá)L-酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol-lyase)，利用葡萄糖生產(chǎn)苯酚，菌株搖瓶發(fā)酵最高產(chǎn)量達(dá)到419 mg/L，補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)1．69 g/L。苯酚由于其對(duì)微生物的毒性，限制了其發(fā)酵積累，通過(guò)兩相補(bǔ)料分批發(fā)酵21 h配合甘油三丁酸酯萃取苯酚產(chǎn)量和產(chǎn)率分別提高至3．79 g/L和 0．18 g/(L·h)。

對(duì)羥基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid，HBA)是重要的有機(jī)合成原料，還廣泛用于食品、化妝品、醫(yī)藥的防腐防霉和殺菌等方面。Frost等［13］過(guò)表達(dá)抗反饋抑制的DAHP合成酶和3-脫氫奎尼酸合成酶，再由ubiC編碼的分支酸裂解酶將分支酸轉(zhuǎn)化為對(duì)羥基苯甲酸，以葡萄糖為碳源最高產(chǎn)量達(dá)12 g/L，產(chǎn)率為0．13 mol/mol。

3 L-苯丙氨酸及其衍生物

3.1 大腸桿菌代謝工程合成L-苯丙氨酸

預(yù)苯酸經(jīng)PheA催化得到苯丙酮酸，苯丙酮酸經(jīng)過(guò)AspC、TyrB轉(zhuǎn)氨酶催化得到L-苯丙氨酸。L-苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一，醫(yī)藥工業(yè)上可作為復(fù)配氨基酸輸液的重要成份，是苯丙氨芐、甲酸溶肉瘤素等氨基酸類抗癌藥物的中間體，也是生產(chǎn)腎上腺素、甲狀腺素的原料;在食品工業(yè)上用作合成甜味劑阿斯巴甜。此外，L-苯丙氨酸相關(guān)的芳香族衍生物的大腸桿菌代謝工程合成也取得了很多進(jìn)展，如圖3a。

陳堅(jiān)等［14］通過(guò)亞硝基胍誘變得到具有Thr326Pro突變的PheA，突變的大腸桿菌同時(shí)共表達(dá)aroF基因，在3 L發(fā)酵罐中產(chǎn)量達(dá)到35．38 g/L，比原始菌株高2．81倍，產(chǎn)率達(dá)到0．26 mol/mol，是原始菌株2倍。Packdibamrung等［15］大腸桿菌中表達(dá)來(lái)自于Thermotolerant bacillus lentus的L-苯丙氨酸脫氫酶(Phenylalanine dehydrogenase)、芳香氨基酸外轉(zhuǎn)運(yùn)基因yddG和編碼甘油轉(zhuǎn)運(yùn)輔因子基因glpF，甘油作為碳源5 L發(fā)酵罐發(fā)酵L-苯丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到366 mg/L。

3.2 大腸桿菌代謝工程合成L-苯丙氨酸衍生物

扁桃酸(mandelate)是藥物合成重要的原料，可用于頭孢羥唑、血管擴(kuò)張藥環(huán)扁桃酯、滴眼藥鹽酸羥芐唑、匹莫林等的合成。楊晟等［16］通過(guò)大腸桿菌對(duì)L-苯丙氨酸合成途徑基因改造實(shí)現(xiàn)以葡萄糖為碳源合成光學(xué)純的扁桃酸。通過(guò)引入Amycolatopsis orientalis的對(duì)羥基扁桃酸合成酶(Hydroxymandelate synthase)得到S-扁桃酸產(chǎn)量0．092 g/L的工程菌。敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑基因tyrA，24 h產(chǎn)量達(dá)到0．74 g/L。在S-扁桃酸生產(chǎn)菌株中共表達(dá)天藍(lán)色鏈霉菌對(duì)羥基扁桃酸氧化酶(Hydromandelate oxidase)和Rhodotorula graminis D-扁桃酸脫氫酶(D-mandelate dehydrogenase))，可生產(chǎn) R-扁桃酸 0．68 g/L。

苯乙烯(styrene)是合成樹脂、離子交換樹脂及合成橡膠等高分子聚合物材料的重要單體。David等［17］在大腸桿菌中共表達(dá)從細(xì)菌，酵母，植物中篩選L-苯丙氨酸氨解酶(Phenylalanine ammonia-lyase)和反式肉桂酸脫羧酶同工酶，實(shí)現(xiàn)由內(nèi)源L-苯丙氨酸向苯乙烯的轉(zhuǎn)化。最終選擇在L-苯丙氨酸高產(chǎn)大腸桿菌工程菌種過(guò)表達(dá)來(lái)自于Arabidopsis thaliana的L-苯丙氨酸氨解酶和來(lái)自于Saccharomyces cerevisiae的阿魏酸脫羧酶(Ferulate decarboxylase)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到260 mg/L，接近苯乙烯毒性極限。

D-苯甘氨酸(D-phenylglycine)是半合成青霉素類和頭孢菌素類抗生素重要的側(cè)鏈單元。Muller等［18］從L-苯丙氨酸前體苯丙酮酸起始，人工構(gòu)建了一條新的D-Phg合成途徑，由分別來(lái)自Amycolatopsis orientalis，Streptomyces coelicolor和 Pseudomonas putida的3種酶對(duì)羥基扁桃酸合成酶(Hydroxymandelate synthase)，對(duì)羥基扁桃酸氧化酶(Hydroxymandelate oxidase)和D-對(duì)羥基苯甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (Hydroxyphenylglycine aminotransferase)組成，將苯丙酮酸經(jīng)過(guò)扁桃酸，苯乙酮酸轉(zhuǎn)化為D-苯甘氨酸。

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)是可以抑制腐敗菌、致病菌，特別是對(duì)真菌的感染，有望成為一種新型的防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè)及藥物制劑;苯乙酸(phenylacetic acid，PAA)在醫(yī)藥工業(yè)中用于青霉素、地巴唑等藥物合成，還可用作生產(chǎn)廣譜有機(jī)磷殺蟲劑農(nóng)藥，合成香料等;苯乙醇(phenethylalcohol，PA)可作為食用香料，也在化妝品、香皂中經(jīng)常應(yīng)用，還可作為眼藥水中的抗菌成分。Sakai等［5］利用跟高產(chǎn)L-酪氨酸菌株生產(chǎn)對(duì)羥基苯乳酸，對(duì)羥基苯乙酸，對(duì)羥基苯乙醇同樣的基因表達(dá)及生產(chǎn)策略，將基因整合到高產(chǎn)L-苯丙氨酸基因組上，可以得到苯乳酸，苯乙酸，苯乙醇生產(chǎn)菌株。

4 L-色氨酸及其衍生物

4.1 大腸桿菌代謝工程合成L-色氨酸

分支酸在氨基苯甲酸合成酶作用下與L-谷氨酰胺(L-glutamine)發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用生成鄰氨基苯甲酸(2-aminobenzoic acid，ABA)，后其經(jīng)過(guò)多步酶促反應(yīng)生成含五元雜環(huán)的芳香族化合物吲哚(indole)，吲哚與絲氨酸(serine)在色氨酸合成酶催化下最終生成L-色氨酸。色氨酸是是人體必需的氨基酸之一，作為營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑用于食品工業(yè);用于煙酸缺乏癥治療藥及調(diào)節(jié)精神節(jié)律安神藥用于醫(yī)藥領(lǐng)域，另外L-色氨酸還大量應(yīng)用于飼料工業(yè)。L-色氨酸生產(chǎn)菌株通常通過(guò)傳統(tǒng)的誘變育種篩選，但有益突變頻率低，變異的方向和性質(zhì)難控制，因此通過(guò)代謝工程理性設(shè)計(jì)以提高其產(chǎn)量逐漸成為研究熱點(diǎn)，并拓展到與色氨酸代謝途徑相關(guān)的芳香族衍生物，如圖3b。

祁慶生等［19-21］在產(chǎn) L-色氨酸工程大腸桿菌體內(nèi)導(dǎo)入可以改變胞內(nèi)代謝通路和氧化還原狀態(tài)的聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate)途徑，有效地增加了L-色氨酸產(chǎn)量，達(dá)到14．4 g/L。通過(guò)構(gòu)建 L-色氨酸通透酶Mtr，TnaB，AroP突變菌株，抑制大腸桿菌對(duì)L-色氨酸的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，增加胞外發(fā)酵液中的L-色氨酸濃度至16．3 g/L。通過(guò)過(guò)表達(dá)tktA和突變的trpE和aroG基因及阻斷一系列競(jìng)爭(zhēng)途徑得到原始產(chǎn)L-色氨酸菌株，后通過(guò)一步法弱化子失活和啟動(dòng)子對(duì)換策略對(duì)代謝通路優(yōu)化，其產(chǎn)量比原始產(chǎn)L-色氨酸菌株分別高1．67和9．29倍，48 h發(fā)酵罐發(fā)酵最高產(chǎn)量達(dá)到10．15 g/L。

陳堅(jiān)等［22］通過(guò)定點(diǎn)突變消除AroF和鄰氨基苯甲酸合成酶(TrpED)的受到的反饋抑制，并在溫度誘導(dǎo)的表達(dá)型質(zhì)粒pSV上表達(dá)兩突變基因。敲除trpR基因解除trp抑制子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，敲除pheA、tyrA和tnaA基因分別阻斷L-苯丙氨酸、L-酪氨酸途徑與L-色氨酸途徑的競(jìng)爭(zhēng)及其降解，最終發(fā)酵L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)到13．3 g/L。

陳寧等［23-25］通過(guò)修飾芳香氨基酸分泌基因yddG和芳香氨基酸透過(guò)酶AroP構(gòu)成的L-色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，影響L-色氨酸的生產(chǎn)和細(xì)胞生長(zhǎng)，使得L-色氨酸合成代謝流重新分配。最優(yōu)化的工程菌株在30 L發(fā)酵罐中補(bǔ)料分批發(fā)酵L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)36．3 g/L。通過(guò)敲除大腸桿菌pta和mtr基因，并過(guò)表達(dá)yddG基因，30 L發(fā)酵罐發(fā)酵 L-色氨酸最大產(chǎn)量可達(dá)48．68 g/L。通過(guò)過(guò)表達(dá)ppsA和tktA，增加胞內(nèi)PEP和E4P供應(yīng)，分批發(fā)酵40 h L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)到35．9 g/L。

4.2 大腸桿菌代謝工程合成L-色氨酸衍生物

吲哚3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，又稱生長(zhǎng)素，對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。Romasi等［26］在大腸桿菌中表達(dá) aspC，ipdC和 iad1三個(gè)基因，分別編碼來(lái)自于Escherichia coli、Enterobacter cloacae和Ustilago maydis的氨基轉(zhuǎn)移酶、吲哚3-丙酮酸脫羧酶和吲哚-3-乙酸脫氫酶。tac啟動(dòng)子控制表達(dá)ipdC和iad1及來(lái)自于Corynebacterium glutamicum的sod啟動(dòng)子控制表達(dá)aspC，重組大腸桿菌在添加2 g/L L-色氨酸LB培養(yǎng)基發(fā)酵48 h，IAA產(chǎn)量約1．1 g/L，進(jìn)一步敲除抑制L-色氨酸生成的tnaA基因，IAA產(chǎn)量增至1．8 g/L。當(dāng)添加4 g/L L-色氨酸至LB培養(yǎng)基發(fā)酵24 h，IAA 產(chǎn)量達(dá)3．0 g/L。

靛紅(indirubin)和靛藍(lán)(indigo)是應(yīng)用廣泛的還原染料，用于食品、醫(yī)藥和日用化妝品的著色。Han等［27］在大腸桿菌中表達(dá)來(lái)自于 Methylophaga aminisulfidivorans的黃素單加氧酶(Flavin-containing monooxygenase)，并在5 L含2 g/L L-色氨酸的培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到920 mg/L靛藍(lán)和5．0 mg/L靛紅。培養(yǎng)基中進(jìn)一步添加0．36 g/L的半胱氨酸，半胱氨酸會(huì)影響黃素單加氧酶的區(qū)域選擇性，增加靛紅前體2-羥基吲哚的合成，利用優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵靛紅產(chǎn)量達(dá)到223．6 mg/L。

紫色桿菌素(violacein)和脫氧紫色桿菌素(deoxyviolacein)具有很好的生物活性，可以作為潛在的抗腫瘤、抗病毒藥物及生物染料。Wittmann等［28］在大腸桿菌中表達(dá)來(lái)自于Chromobacterium violaceum的vioABCE基因簇，可以積累脫氧紫色桿菌素達(dá)180 mg/L，進(jìn)一步通過(guò)胞內(nèi)代謝分析找到絲氨酸、分支酸和色氨酸生物合成及磷酸戊糖途徑瓶頸，并進(jìn)行系統(tǒng)改造，搖瓶發(fā)酵脫氧紫色桿菌素積累量增至320 mg/L。將來(lái)自于Janthinobacterium lividum的vioD基因整合到工程大腸桿菌基因組上，紫色桿菌素成為唯一的終產(chǎn)物，補(bǔ)料分批發(fā)酵其產(chǎn)量達(dá)710 mg/L。

血清素(serotonin)是一種植物源的生物堿，具有潛在的藥理作用。Sangkyu等［29］在含有GST(Glutathione S transferase)標(biāo)簽蛋白的質(zhì)粒pCOLADuet-1上融合表達(dá)色胺5-羥化酶(Tryptamine 5-hydroxylase)，使其在大腸桿菌中具有活性，并同時(shí)共表達(dá)色氨酸脫羧酶(Tryptophan decarboxylase)，在約20℃誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白可有最高的可溶性，此時(shí)血清素產(chǎn)量達(dá)24 mg/L。

5 展望

隨著化石資源的枯竭，化石能源基產(chǎn)品需要尋求新的可持續(xù)替代來(lái)源;天然產(chǎn)物提取因受到季節(jié)地域成本等影響，其發(fā)展也有很大的局限性。芳香族化合物作為在醫(yī)藥，食品，化妝品，化工等各領(lǐng)域具有重要作用的產(chǎn)品，其來(lái)源也需要我們重新思考。單純傳統(tǒng)微生物育種已經(jīng)遇到生產(chǎn)能力無(wú)法提高的瓶頸，也不能滿足人們對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品多樣性的需求。必須與現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)相結(jié)合，以發(fā)揮微生物發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)。

代謝工程通過(guò)重新合理設(shè)計(jì)和優(yōu)化微生物的代謝途徑來(lái)更好地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)，廣泛應(yīng)用于微生物的改造取得了顯著成效。近年來(lái)，隨著各種組學(xué)的發(fā)展，對(duì)于全細(xì)胞尺度的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組調(diào)控機(jī)理研究得越來(lái)越清晰，加之合成生物學(xué)理論的提出，從原件、模塊、系統(tǒng)不同層次設(shè)計(jì)特定功能合成的生命體成為未來(lái)的趨勢(shì)。在大腸桿菌等模式生物研究基礎(chǔ)之上，不斷優(yōu)化并構(gòu)建高產(chǎn)高效微生物細(xì)胞工廠，再結(jié)合工業(yè)微生物發(fā)酵和過(guò)程技術(shù)，最終實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展。

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