戊糖片球菌產(chǎn)蛋白酶對(duì)發(fā)酵鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠性能的影響*

戴夢(mèng)婕，許艷順，姜啟興，夏文水

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫，214112)

我國(guó)淡水魚(yú)資源豐富，發(fā)酵是一種重要的淡水魚(yú)加工手段。生物發(fā)酵可以改善淡水魚(yú)糜制品風(fēng)味，賦予產(chǎn)品獨(dú)特的凝膠質(zhì)構(gòu)和口感，同時(shí)還增加了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，延長(zhǎng)了保質(zhì)期［1］。近年來(lái)，研究人員對(duì)發(fā)酵魚(yú)糜的工藝進(jìn)行了系統(tǒng)研究，通過(guò)單一和混合發(fā)酵劑進(jìn)行淡水魚(yú)糜發(fā)酵，得到了具有風(fēng)味獨(dú)特、高凝膠強(qiáng)度的發(fā)酵魚(yú)糜制品［2-3］。凝膠性能是體現(xiàn)魚(yú)糜制品品質(zhì)的重要指標(biāo)，魚(yú)糜凝膠形成機(jī)理受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注，目前對(duì)它的機(jī)理研究主要集中在微生物發(fā)酵產(chǎn)酸對(duì)凝膠形成的作用方面［4］。微生物在發(fā)酵過(guò)程中除了產(chǎn)酸還會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，如微生物酶、胞外多糖等，微生物產(chǎn)酶對(duì)魚(yú)糜的影響不能忽視，但是有關(guān)微生物酶在魚(yú)糜凝膠形成中的作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本文選取1株廣泛用于發(fā)酵魚(yú)糜工藝的菌種——戊糖片球菌作為產(chǎn)酶研究對(duì)象，利用葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)和抗生素建立模擬發(fā)酵體系，探討戊糖片球菌產(chǎn)酶對(duì)魚(yú)肉蛋白及鰱魚(yú)肌動(dòng)球蛋白的蛋白質(zhì)降解作用以及其對(duì)魚(yú)糜凝膠性能的影響。

1 材料，設(shè)備和方法

1.1 材料與設(shè)備

1．1．1 主要材料

鰱魚(yú):鮮活，體重2～3 kg/條，購(gòu)于無(wú)錫雪浪農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

菌種:戊糖片球菌，由食品學(xué)院提供。

葡糖糖酸內(nèi)酯(GDL)，含量≥99%，食品級(jí)。

1．1．2 主要試劑

青霉素，中諾藥業(yè)有限公司;鏈霉素，深圳華藥南方制藥有限公司;兩性霉素B，上海金穗生物科技有限公司;干酪素、(NH4)2SO4、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷(tris)等，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1．1．3 主要儀器和設(shè)備

TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Sable Micro Systems公司;S3500激光粒度分析儀，美國(guó)Microtrac公司;冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司;UV-1000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司;pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器上海有限公司;西貝樂(lè)SQ2119DX多功能食品加工機(jī)，上海帥佳電子科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 戊糖片球菌產(chǎn)酶及粗酶液提純

將經(jīng)過(guò)2次活化的戊糖片球菌以4%的接種量接種到液體MRS培養(yǎng)基中33℃培養(yǎng)20 h后，10 000 g離心15 min(4℃)，上清液即為粗酶液。用不同的飽和度的(NH4)2SO4溶液鹽析粗酶液，置4℃冰箱中過(guò)夜，選擇60%最佳飽和度使蛋白質(zhì)沉淀完全后，于10 000 g，4℃離心15 min，用Tris-HCl緩沖液(pH 6．8)按1∶5(V/V)溶解沉淀后透析［5］。采用紫外法測(cè)定酶活。

1．2．2 建立模擬酸化體系

將新鮮鰱魚(yú)(2～3 kg/條)去頭、清洗、取肉后，添加2．5g/100g 葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)、抗生素［6］(20 mg/100 g青霉素，20 mg/100 g鏈霉素，20 mg/100 g兩性霉素)、2%葡糖糖、2%食鹽制成魚(yú)糜樣品。將魚(yú)糜樣品分成均等的2份，1份按照200 u/100 g魚(yú)糜添加粗酶液制成加酶組［7］，另1份每100 g魚(yú)糜添加與粗酶液等量體積的 Tris-HCl緩沖液(pH 6．8)作為空白對(duì)照。將2份樣品攪拌均勻后灌腸，置于30℃的培養(yǎng)箱中。

1．2．3 鰱魚(yú)肌動(dòng)球蛋白的提取

提取方法參照 Riebroy等的方法［8］，將魚(yú)肉絞碎，加入5倍(w∶v)的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6．8)，內(nèi)含有 0．05 mol/L NaCl，勻漿，5，000 g，4 ℃離心10 min棄去上清液，沉淀部分按上述步驟重復(fù)操作2次。將收集的沉淀懸浮于10倍(w∶v)的0．6 mol/L NaCl溶液(pH 7．0)中，勻漿，10 000 g，4 ℃離心10 min，用尼龍網(wǎng)過(guò)濾去除上清液的結(jié)締組織后加入3倍體積的冷蒸餾水是肌動(dòng)球蛋白沉淀，10 000 g，4℃離心10 min收集沉淀，即為肌動(dòng)球蛋白樣品。用0．6 mol/L NaCl溶液將肌動(dòng)球蛋白溶解稀釋到10 mg/mL，用HCl溶液調(diào)節(jié) pH 值分別為5．0和4．5。按1∶1體積比添加粗酶液，35℃反應(yīng)24 h后進(jìn)行濁度，粒徑，TCA-溶解肽等指標(biāo)測(cè)定。

1．2．4 pH 及微生物分析

取10 g魚(yú)糜，加入90 mL生理鹽水均質(zhì)后用pH計(jì)測(cè)定pH值。無(wú)菌取樣10 g，加入90 mL無(wú)菌生理鹽水，混合均勻后吸取1 mL上清液進(jìn)行梯度稀釋，選擇適合梯度采用涂布平板法在PCA培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1．2．5 非蛋白氮含量測(cè)定

非蛋白氮含量測(cè)定參考Dierick［9］等的方法。

1．2．6 TCA-溶解肽含量的測(cè)定

參照Visessanguan等［10］的方法，取3 g絞碎的魚(yú)糜樣品，加入27 mL 4℃的5%的TCA溶液，均質(zhì)后于4℃靜置1 h后，在4℃下12，000 g離心15 min，以牛血清蛋白(BSA)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用雙縮脲法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量。TCA-溶解肽含量用μmol tyrosine/g表示。測(cè)定肌動(dòng)球蛋白TCA-溶解肽的變化處理樣品時(shí)用10%TCA溶液與肌動(dòng)球蛋白按體積比1∶1混合，其他步驟與測(cè)定魚(yú)糜樣品一致。

1．2．7 濁度分析

將肌動(dòng)球蛋白稀釋到0．2 mg/mL，進(jìn)行相應(yīng)處理后測(cè)定在350 nm處的吸光度值。

1．2．8 粒徑分析

將肌動(dòng)球蛋白稀釋到1 mg/mL，用激光粒度分析儀測(cè)定蛋白粒徑。

1．2．9 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

參照Benjakul等［11］的方法，用20 mm長(zhǎng)的凝膠樣品(去除腸衣)放置在TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀試驗(yàn)臺(tái)上，采用P50s球形探頭，以1．0 mm/s速度穿刺樣品至strain 50%處，穿刺曲線上的第1個(gè)峰即為破斷強(qiáng)度，對(duì)應(yīng)的距離為凹陷深度。

凝膠強(qiáng)度(g·cm)=破斷強(qiáng)度(g)×凹陷深度(cm)

破斷強(qiáng)度反映凝膠硬度，凹陷深度反映魚(yú)糜凝膠彈性。每個(gè)樣品做3次平行測(cè)定。

1．2．10 數(shù)據(jù)處理

采用軟件Origin8．5和SPSS 18對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 數(shù)據(jù)與分析

2.1 模擬酸化體系pH變化

從圖1中看出，空白組和加酶組在加入GDL和抗生素4 h后pH值從6．5左右降到4．5左右，并在之后的92 h內(nèi)兩者無(wú)明顯差異，pH值在4．5上下略有浮動(dòng)。根據(jù)其他學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，pH值的降低會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性，對(duì)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度產(chǎn)生影響［3］，保持pH值穩(wěn)定性與一致性有利于在酸化體系中客觀評(píng)價(jià)微生物酶對(duì)蛋白質(zhì)的作用以及凝膠性能的影響。

圖1 酸化體系pH變化Fig．1 The changes of pH in the acidified system

2.2 模擬酸化體系微生物分析

如圖2顯示，由于抗生素的作用以及GDL產(chǎn)生的低酸環(huán)境，酸化體系中的微生物的生長(zhǎng)繁殖受到一定抑制，在96 h的反應(yīng)過(guò)程中，增長(zhǎng)趨勢(shì)平緩，菌落總數(shù)控制在104～105CFU/g，不添加抗生素的自然條件下魚(yú)糜微生物數(shù)量由初始值104～105CFU/g在24 h內(nèi)快速增長(zhǎng)至108CFU/g，并在之后72 h保持增長(zhǎng)最終達(dá)到109～1010CFU/g，遠(yuǎn)高于添加抗生素和GDL的模擬酸化體系中微生物數(shù)量。微生物發(fā)酵魚(yú)糜中的微生物生長(zhǎng)情況與酸化體系相似，發(fā)酵菌種成為魚(yú)糜發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌，抑制了其他雜菌的生長(zhǎng)，除了發(fā)酵菌種本身外的其他菌數(shù)量也在104～105CFU/g。

圖2 酸化體系微生物變化Fig．2 Microbiological changes in the acidified system

2.3 酸化體系蛋白質(zhì)降解分析

非蛋白氮的增加是由于魚(yú)肉蛋白在微生物蛋白酶和內(nèi)源組織蛋白酶的作用下發(fā)生了降解作用，生成了低分子質(zhì)量的多肽和游離氨基酸等。從圖3中發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)過(guò)程中，空白組與加酶組的非蛋白氮含量在反應(yīng)24 h時(shí)較為接近，分別為4．31和4．93 mgN/g，加入蛋白酶的樣品非蛋白氮增長(zhǎng)迅速，在96 h時(shí)達(dá)到 9．73 mgN/g，此時(shí)空白組只有 8．47 mgN/g。添加的戊糖片球菌蛋白酶在酸化體系中與蛋白質(zhì)作用，和內(nèi)源酶共同生成了較多的低分子質(zhì)量多肽和游離氨基酸。尤其在24h之后，加酶樣與空白樣差異性增大，產(chǎn)生的非蛋白氮含量明顯增多。

圖3 酸化體系NPN變化Fig．3 The changes of NPN in the acidified system

由圖4可知，酸化體系中TCA-溶解肽隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，同時(shí)加酶組的含量在96 h中一直高于空白組，增加速度快，含量高，在96 h時(shí)加酶組含量多 達(dá) 156．2 μmol Tyr/g，比 空 白 組 高 出 27．7 μmol Tyr/g，與開(kāi)始24 h相比，加酶組與空白組間差異明顯加大，這說(shuō)明戊糖片球菌產(chǎn)酶對(duì)魚(yú)糜中蛋白質(zhì)產(chǎn)生降解作用，魚(yú)糜中低分子肽和游離氨基酸含量增多［12］，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，戊糖片球菌產(chǎn)酶對(duì)魚(yú)糜的作用更加顯著。

圖4 酸化體系TCA-溶解肽變化Fig．4 The changes of TCA-soluble peptides in the acidified system

2.4 鰱魚(yú)肌動(dòng)球蛋白降解及聚集程度分析

圖5顯示了在2種不同pH下的鰱魚(yú)肌動(dòng)球蛋白TCA-溶解肽的變化。在pH4．5的肌動(dòng)球蛋白中，加入戊糖片球菌蛋白酶的樣品TCA-溶解肽含量明顯高于空白樣含量，pH 5．0的肌動(dòng)球蛋白中加酶樣比空白樣的含量有增加，但增幅不明顯。這一方面是因?yàn)槲焯瞧蚓a(chǎn)的蛋白酶為酸性蛋白酶，其最適pH更接近4．5，對(duì)蛋白質(zhì)降解程度大于pH 5．0的肌動(dòng)球蛋白。

圖5 肌動(dòng)球蛋白TCA-溶解肽變化Fig．5 The changes of TCA-soluble peptides in silver carp actomyosin

濁度和粒徑可以用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的聚集動(dòng)力學(xué)過(guò)程。2種pH下肌動(dòng)球蛋白的濁度和粒徑的變化見(jiàn)表1。從表1中看出，pH 5．0條件下的濁度在加酶前和加酶反應(yīng)后都低于pH 4．5條件下的濁度。濁度的增加表明肌動(dòng)球蛋白分子相互作用形成了大分子聚集物，利用分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)導(dǎo)致光散射增加［13］。2種pH下加入蛋白酶反應(yīng)后濁度降低，說(shuō)明蛋白酶的作用破壞了肌動(dòng)球蛋白的聚集狀態(tài)，由于蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)直接影響凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，蛋白的聚集狀態(tài)被蛋白酶破壞后，對(duì)凝膠形成亦造成破壞作用。從粒徑角度分析，總體上粒徑隨著pH的降低而增大，同時(shí)蛋白酶的加入導(dǎo)致粒徑減小，pH4．5條件下由91．26 μm 減低到 85．30 μm。而 pH 5．0 條件下，加入酶反應(yīng)24 h后粒徑減小3．74 μm ，pH 4．5 條件下減小幅度更為明顯。

表1 肌動(dòng)球蛋白濁度及粒徑變化Table 1 The changes of turbidity and particle size in silver carp actomyosin

2.5 酸化體系凝膠強(qiáng)度測(cè)定

表2反映了蛋白酶加入模擬發(fā)酵體系后對(duì)魚(yú)糜蛋白的凝膠強(qiáng)度的影響。在體系形成4 h后，隨著模擬發(fā)酵體系的pH值下降并趨于穩(wěn)定，因?yàn)镚DL作用魚(yú)糜的凝膠強(qiáng)度較大。隨后在12 h及24 h中魚(yú)糜的破斷強(qiáng)度和凹陷深度的變化較小，魚(yú)糜的硬度和彈性保持穩(wěn)定，添加蛋白酶的魚(yú)糜與空白組之間差距不明顯，甚至在12h時(shí)加酶組的凝膠強(qiáng)度略大于空白組。在24 h后空白組和加酶組的凝膠強(qiáng)度都開(kāi)始明顯下降，但加酶組魚(yú)糜的彈性和硬度下降幅度更大，加酶組魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度始終低于空白組，在96 h后空白組的凹陷深度減少0．11 cm，加酶組減少0．14 cm;空白組破斷強(qiáng)度減少299．1 g，加酶組減少354．9 g，其彈性和硬度明顯低于空白組。加酶組96 h時(shí)的凝膠強(qiáng)度僅為4 h時(shí)凝膠強(qiáng)度的32．9%。造成空白組和加酶組凝膠強(qiáng)度降低及兩者差異的原因可能是空白組魚(yú)糜中的內(nèi)源組織蛋白酶對(duì)蛋白產(chǎn)生降解作用，而加酶組則由內(nèi)源組織蛋白酶和微生物酶共同作用，在魚(yú)糜凝膠形成后對(duì)凝膠產(chǎn)生劣化影響。

3 結(jié)論

在穩(wěn)定的低酸性環(huán)境中，戊糖片球菌產(chǎn)蛋白酶降解了魚(yú)糜中蛋白質(zhì)，生成了低分子肽和游離氨基酸。蛋白酶一定程度上破壞了肌動(dòng)球蛋白的聚集，并且在pH 4．5條件下蛋白酶對(duì)肌動(dòng)球蛋白的影響更大。戊糖片球菌產(chǎn)蛋白酶對(duì)魚(yú)糜凝膠的硬度和彈性都產(chǎn)生劣化影響并且作用強(qiáng)度隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增大，作用時(shí)間主要在凝膠形成24 h后。這些有關(guān)戊糖片球菌產(chǎn)酶對(duì)發(fā)酵魚(yú)糜的研究在進(jìn)一步了解了發(fā)酵魚(yú)糜凝膠形成機(jī)理的同時(shí)將有助于今后發(fā)酵魚(yú)糜工藝的改進(jìn)及發(fā)展。

表2 不同時(shí)間下空白組和加酶組的凝膠強(qiáng)度變化Table 2 The changes of gel strength in the acidified system

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