熱水處理對冷藏新余蜜橘活性氧代謝的調(diào)節(jié)*

陳楚英，陳明，周夢嬌，韓舒睿，陳金印

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西省果蔬保鮮與無損檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌，330045)

新余蜜橘是新余市科技工作者1977年從本地早中選育出的優(yōu)良特色寬皮柑橘品種，屬于高糖、低酸、VC含量豐富的果品［1］。但由于新余蜜橘采后代謝旺盛，果皮薄、松脆，易碰傷造成爛果現(xiàn)象，在貯運(yùn)過程中易遭受微生物侵染，嚴(yán)重限制了新余蜜橘相關(guān)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

熱處理作為一種控制果蔬采后腐爛的物理保鮮方法，具有安全無毒、無化學(xué)殘留、操作簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來果蔬保鮮研究的熱點(diǎn)。大量的研究報道指出，貯前短時熱處理可以降低果蔬對低溫的敏感性，提高果蔬抗寒、抗病能力以及貯藏效果［2-6］。Sala等［7］研究報道熱水(53 ℃、3 min)和熱空氣(37℃、3 d)處理均可以提高“Fortune”和“Clementine”柑橘果實(shí) CAT、SOD、APX、GR 的活性，降低果實(shí)的自由基含量，減少果實(shí)冷害的發(fā)生。Lafuente［8］等研究了熱空氣處理(37℃、3 d)可以使“Fortune”柑橘果實(shí)AsA和多酚抗氧化物質(zhì)的含量分別提高為原來的1.7倍和2.1倍，且抗氧化物質(zhì)在2℃冷藏中能夠保持較高的含量，提高了果實(shí)的抗氧化能力，減少了果實(shí)冷害的發(fā)生幾率?？梢?，保持植物體內(nèi)較高的抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量，可減少自由基和活性氧的積累，延緩果實(shí)的衰老。目前活性氧代謝在果實(shí)成熟衰老中的研究大多集中在植物果實(shí)采前［9-11］，而活性氧代謝變化在果實(shí)采后貯藏方面的研究較少;近年來，國內(nèi)外眾多科研人員對熱處理果實(shí)貯藏保鮮進(jìn)行了多項(xiàng)試驗(yàn)性研究，但是主要還是集中在應(yīng)用研究上，其作用機(jī)理的研究進(jìn)展緩慢［2，4，12-15］。本文作者研究了新余蜜橘果實(shí)在冷藏下活性氧與抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的變化，對熱處理后新余蜜橘果實(shí)的活性氧代謝作初步探討，以探索采后熱處理在新余蜜橘果實(shí)貯藏保鮮中應(yīng)用的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試新余蜜橘(Citrus reticulata Blanco)果實(shí)于2012年10月24日采自于江西省新余市。采后立即裝箱當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，預(yù)貯2 d。挑選大小一致、色澤均勻、無病蟲害和機(jī)械損傷的健康果實(shí)分成2組，一組為對照組(CK);另一組為熱水處理組(HWD)。熱水處理53℃、3 min，自然晾干后，用PE保鮮袋(d=0.03 mm)包裝，于(5±0.5)℃(RH 80% ～95%)條件下貯藏。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 過氧化氫(H2O2)含量的測定

參考鄒琦方法［16］。稱取5.0果皮，加入8.0 mL預(yù)冷的丙酮，在通風(fēng)櫥中冰浴條件下研磨成漿，離心(4℃、10 000 r/min，20 min)，收集上清液。取1.0 mL上清液，加入0.1 mL 5%硫酸鈦溶液和0.2 mL濃氨水，混勻反應(yīng) 5 min后，4℃、10 000 r/min離心 15 min，取沉淀再用-20℃預(yù)冷丙酮反復(fù)洗滌3～5次，直至出去色素，最后將沉淀溶于3.0 mL 2mol/L H2SO4溶液中，以丙酮做空白參比，于415 nm測定吸光度值，重復(fù)3次。按同樣的方法制作H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線，H2O2含量以μmol/g表示。

1.2.2 丙二醛(MDA)含量的測定

采用硫代巴比妥酸(TBA)法［17］。稱取1.0 g果皮，加入10 mL 0.05 mol/L、pH 7.8磷酸緩沖液冰浴條件下研磨成漿后，離心(4℃、10 000 r/min，15 min)，上清液為樣品提取液。取上清液2 mL，加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，混勻后于沸水浴中反應(yīng)30 min，迅速冷卻后在離心(4℃、6 000 r/min，10 min)。以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白對照，測定上清液在532、600和450 nm波長下的吸光值。

1.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)酶活性測定

參考Sala方法測定［18］，SOD活性以每克新余蜜橘果皮抑制氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原的50%為一個酶活性單位(U)表示。SOD活性單位以U/g表示。重復(fù)測定3次。

1.2.4 過氧化氫酶(CAT)活性測定

參考Bassal方法測定［2］。從加入酶液 15 s開始記錄每30 s反應(yīng)體系在240 nm的吸光度值，連續(xù)3 min。以每分鐘吸光度變化值減少0.01為1個CAT活性單位(U)。CAT酶活性表示為U/g。

1.2.5 抗壞血酸(AsA)含量測定

采用2，6-二氯酚靛酚法測定，結(jié)果以mg/100 g表示。

1.2.6 還原型谷胱甘肽(GSH)含量測定

參考 Brehe和Burch方法［19］。稱取3.0 g果皮，加入5 mL經(jīng)4℃預(yù)冷、含50 g/L TCA溶液(含5 mmol/L EDTA-Na2)在冰浴條件下研磨勻漿，離心(4℃、10 000 r/min，20 min)，上清液為樣品提取液。取1.0 mL上清液，加入1.0 mL 0.1mol/L、pH 7.7磷酸緩沖液和 0.5 mL 4 mmol/L DTNB溶液(用 0.1 mol/L、pH 6.8磷酸緩沖液配制)，于25℃保溫反應(yīng)10 min，測定412 nm吸光值。參比空白加 0.5 mL 0.1 mol/L、pH 6.8磷酸緩沖液代替 DTNB溶液，GSH含量表示為μg/g。重復(fù)測定3次。

1.2.7 過氧化物酶(POD)活性測定

參考曹建康方法［20］，并稍加修改。取1支試管，加入3.0 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚和0.2 mL酶提取液，再加入0.2 mL 0.5mol/L H2O2溶液迅速混合啟動反應(yīng)，同時開始計時。以蒸餾水為參比，在反應(yīng)15 s時開始記錄反應(yīng)體系每30 s在470 nm的吸光度值，連續(xù)測定3 min。以每克樣品每分鐘吸光度變化值增加1時為1個POD活性單位(U)。酶活性表示為U/g。重復(fù)測定3次。

1.2.8 抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定

參考Asada方法［21］，并稍加修改。稱取2.0 g樣品，加入5 mL經(jīng)4℃預(yù)冷的50 mmol/L、pH 7.0磷酸緩沖液(含0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L抗壞血酸和1%PVP)，冰浴研磨勻漿4℃、10 000 r/min離心30 min，收集上清液即為酶提取液。取1支試管依次加入2.6 mL反應(yīng)緩沖液(含0.1 mmol/L EDTA和0.5 mmol/L抗壞血酸)和0.2 mL酶提取液，最后加入0.3 mL的2 mmol/L H2O2溶液啟動反應(yīng)，連續(xù)記錄測定室溫下OD290的變化，以蒸餾水為參比對照。以每克樣品每分鐘吸光度變化值減少0.01為1個APX活性單位(U)，酶活性以U/g表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用DPS v8.01數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行差異性分析，采用SimaPlot 12.3軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對新余蜜橘過氧化氫含量的影響

植物體內(nèi)積累的H2O2可以直接或間接導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，加速衰老進(jìn)程，其含量在一定程度上可反映果實(shí)在逆境下細(xì)胞膜脂過氧化程度。如圖1所示，熱處理和對照的新余蜜橘果實(shí)H2O2含量在冷藏的最初20 d內(nèi)急劇增加，在隨后80 d內(nèi)有下降趨勢，在貯藏100 d又出現(xiàn)一定程度回升，變化趨勢大致相同。在貯藏前期，熱處理的果實(shí)H2O2含量顯著高于對照處理(P＜0.05)，這表明熱處理提高了新余蜜橘采后果皮中H2O2含量。

圖1 熱水處理對新余蜜橘果實(shí)H2O2含量的影響Fig.1 Effect of heat water dipping on H2O2content of Xinyu tangerine

2.2 熱處理對新余蜜橘丙二醛(MDA)含量的影響

MDA是植物衰老過程中膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，其含量的積累會使膜脂過氧化加強(qiáng)，在一定程度上可反映果實(shí)在逆境下細(xì)胞膜脂過氧化程度。如圖2所示，熱處理和對照的果實(shí)MDA含量在貯藏20 d前差異不顯著，隨著貯藏時間的延長，對照處理的MDA含量明顯上升，而熱處理果實(shí)的MDA的增加量始終低于對照。在整個冷藏期間，熱處理與對照的差異達(dá)顯著水平(P＜0.05)，說明HWD處理可以抑制新余蜜橘果實(shí)MDA含量的上升，從而延緩果實(shí)后熟衰老的進(jìn)程。

圖2 熱水處理對新余蜜橘果實(shí)MDA含量的影響Fig.2 Effect of heat water dipping on MDA content of Xinyu tangerine

2.3 熱處理對新余蜜橘超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

由圖3可知，在貯藏前期，各處理中SOD活性逐漸升高，至貯藏中期時達(dá)到最大值，隨后活性迅速降低。熱處理和對照果實(shí)的SOD活性在貯藏40 d同時達(dá)到活性高峰，峰值分別為39.48 U/g和29.72 U/g，兩者極顯著(P＜0.01);在貯藏中后期(≥50 d)，熱水處理的SOD活性仍保持較高水平，顯著高于對照組(P＜0.05)，這說明熱處理能提高果實(shí)的SOD活性并抑制其在貯藏后期的下降。

圖3 熱水處理對新余蜜橘果實(shí)SOD活性的影響Fig.3 Effect of heat water dipping on SOD activity of Xinyu tangerine

2.4 熱處理對新余蜜橘過氧化氫酶(CAT)活性的影響

新余蜜橘貯藏過程中CAT活性的變化見圖4，各處理新余蜜橘的CAT活性變化趨勢大致相同，均是先上升，達(dá)到活性高峰后開始下降。熱處理和對照果實(shí)的CAT活性分別在貯藏60 d和80 d時達(dá)到活性高峰，峰值分別為124.3 U/g和89.2 U/g;在貯藏中后期，熱處理的新余蜜橘果實(shí)CAT活性極高于對照組，差異極顯著(P＜0.01)，說明熱處理可以在一定程度上提高新余蜜橘對逆境脅迫的抵抗能力，延緩衰老過程，延長貯藏時間。

圖4 熱水處理對新余蜜橘果實(shí)CAT活性的影響Fig.4 Effect of heat water dipping on CAT activity of Xinyu tangerine

2.5 熱處理對新余蜜橘抗壞血酸(AsA)含量的影響

抗壞血酸(AsA)是一種重要的抗氧化劑，可以適當(dāng)清除果蔬正常代謝所產(chǎn)生的自由基，保護(hù)細(xì)胞組織免受膜質(zhì)氧化而延緩果實(shí)衰老的進(jìn)程，同時AsA含量的高低直接反映新余蜜橘果實(shí)品質(zhì)的優(yōu)劣。由圖5可知，在整個冷藏期間，新余蜜橘果實(shí)AsA含量總體都呈先上升后逐漸下降的變化趨勢，熱處理和對照的AsA含量在貯藏20 d達(dá)到最大值，熱處理AsA含量的峰值極顯著高于對照組(P＜0.01);在貯藏結(jié)束時，對照組由峰值的27.72 mg/100 g降至17.98 mg/100 g，HWD處理由峰值的30.74 mg/100 g降至19.85 mg/100 g，這說明熱處理能適當(dāng)提高新余蜜橘的AsA含量，有利于延緩AsA含量的下降。

2.6 熱處理對新余蜜橘還原性谷胱甘肽(GSH)含量的影響

還原型谷胱甘肽(GSH)是植物非酶清除體系中一種重要的抗氧化劑，可以適當(dāng)清除果蔬正常代謝所產(chǎn)生的自由基，GSH含量直接反映新余蜜橘抵御活性氧傷害的能力。熱處理對新余蜜橘果實(shí)GSH含量的影響見圖6，其變化趨勢與AsA相似，在貯藏的前20 d有一個上升過程，達(dá)到一定值后開始下降。在整個冷藏周期里，熱處理的新余蜜橘GSH含量高于對照組，說明熱處理可以適當(dāng)提高新余蜜橘GSH含量的上升并同時抑制其下降速度，使新余蜜橘在貯藏中后期保持較高的GSH含量。

圖5 熱水處理對新余蜜橘果實(shí)AsA含量的影響Fig.5 Effect of heat water dipping on AsA content of Xinyu Tangerine

圖6 熱水處理對新余蜜橘果實(shí)GSH含量的影響Fig.6 Effect of heat water dipping on GSH content of Xinyu Tangerine

2.7 熱處理對新余蜜橘過氧化物酶(POD)活性的影響

過氧化物酶(POD)是植物體內(nèi)抵御活性氧傷害的重要酶類，對減少活性氧積累、抵御膜脂過氧化作用和維護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整性有著重要作用，如圖7所示，對照果實(shí)的POD活性在整個貯藏過程中呈雙峰的變化趨勢，2個峰值分別出現(xiàn)在貯藏20 d和80 d，且第一個峰值高于第二個;而熱處理的新余蜜橘果實(shí)POD活性呈單峰變化趨勢，在貯藏100 d達(dá)到活性后開始下降。在貯藏中后期，熱處理的新余蜜橘POD活性高于對照，兩者差異極顯著(P＜0.01)，說明熱處理可以有效延緩新余蜜橘果實(shí)POD活性高峰的出現(xiàn)并抑制其下降速度。

2.8 熱處理對新余蜜橘抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的影響

圖7 熱水處理對新余蜜橘果實(shí)POD活性的影響Fig.7 Effect of heat water dipping on POD activity of Xinyu Tangerine

抗壞血酸過氧化物酶(APX)是抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環(huán)的關(guān)鍵控制酶，能催化AsA與H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)，達(dá)到清除H2O2的目的。APX活性在新余蜜橘果實(shí)采后冷藏過程中的變化見圖8，隨著果實(shí)的成熟衰老，其活性呈先升高后下降的變化趨勢。熱處理和對照在貯藏100 d時候達(dá)到APX活性高峰，峰值分別為305.4 U/g和265.3 U/g，在整個冷藏周期里，熱處理的果實(shí)APX活性活性高于對照，這說明熱處理能提高果實(shí)的APX活性并抑制其在貯藏后期的下降。

圖8 熱水處理對新余蜜橘果實(shí)APX活性的影響Fig.8 Effect of heat water dipping on APX activity of Xinyu Tangerine

3 討論

果實(shí)采后的衰老與組織內(nèi)活性氧代謝的失調(diào)和細(xì)胞膜質(zhì)的過氧化作用密切相關(guān)。一般認(rèn)為，果實(shí)衰老是由于貯藏時間的延長，果實(shí)機(jī)體內(nèi)清除活性氧自由基能力下降，使活性氧自由基水平升高，活性氧促使細(xì)胞發(fā)生膜脂過氧化而引發(fā)細(xì)胞膜功能的喪失和細(xì)胞膜組織結(jié)構(gòu)的解體導(dǎo)致果實(shí)傷害。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)H2O2是植物體內(nèi)一個新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，因而H2O2與植物抗病性的關(guān)系成為新的研究熱點(diǎn)。目前，人們對活性氧與抗病防衛(wèi)反應(yīng)信息傳遞的關(guān)系存在以下兩種解釋:一種觀點(diǎn)認(rèn)為細(xì)胞代謝產(chǎn)生的H2O2直接作為二級信使參與植物抗病防衛(wèi)反應(yīng);另一種觀點(diǎn)認(rèn)為細(xì)胞產(chǎn)生的H2O2通過激活膜脂過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生某些不飽和脂肪酸的過氧化物作為信號分子，誘發(fā)植物的各種防衛(wèi)反應(yīng)。許多研究還表明，在誘導(dǎo)處理的前期，果實(shí)的活性氧水平迅速升高［22-23］，本試驗(yàn)研究結(jié)果與上述結(jié)果相似，經(jīng)熱處理后的新余蜜橘果皮中H2O2含量在貯藏前期明顯高于對照;同時熱處理降低了新余蜜橘果實(shí)在冷藏過程中MDA含量的積累，使細(xì)胞膜滲透率上升的速度降低，降低膜脂過氧化的程度，這很可能與熱處理提高新余蜜橘的抗病性有關(guān)。

SOD、CAT、POD和APX是植物體內(nèi)酶促活性氧清除系統(tǒng)的主要酶類，可有效地清除活性氧自由基，保持體內(nèi)活性氧平衡，其活性的高低可以作為判斷果實(shí)耐貯性指標(biāo)和衰老的標(biāo)志［24］。SOD是主要的活性氧清除酶，主要催化O2-的歧化反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)變成為無毒的O2和毒性較低的H2O2;POD也是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧的保護(hù)酶之一，同時還可催化形成抑菌的醌類物質(zhì)，提高果實(shí)的抗病性;CAT、APX主要通過不同的途徑將H2O2分解為H2O和O2。AsA、GSH都是植物體內(nèi)活性氧非酶清除體系，這2種抗氧化物質(zhì)的損失將導(dǎo)致植物抵抗活性氧傷害能力的降低［25］，保持AsA-GSH代謝循環(huán)的穩(wěn)定對維持細(xì)胞正常的生理代謝尤為重要［26］。因此，保持植物體內(nèi)較高的活性氧清除酶活性和非酶抗氧化物質(zhì)含量，可減少活性氧的積累，從而有效地防止超氧陰離子自由基和MDA的積累，延緩果實(shí)衰老。

本試驗(yàn)通過熱處理影響新余蜜橘體內(nèi)H2O2代謝酶的活性，與對照相比，熱處理能夠有效增強(qiáng)果實(shí)的活性氧清除酶類SOD、CAT、POD和APX活性，這與Sala和寇莉萍等人利用37℃熱空氣處理3 d和45℃熱水浸泡8 min作用在‘Fortune’柑橘和葡萄果實(shí)上的研究結(jié)果一致［7，27］。試驗(yàn)結(jié)果表明，熱處理能夠影響新余蜜橘體內(nèi) AsA-GSH循環(huán)，提高果實(shí)AsA和GSH含量并延緩AsA和GSH含量在貯藏后期降解速率，這與前人利用殼聚糖處理柑橘果實(shí)誘導(dǎo)抗病性的研究上也有類似的結(jié)果［23，28］。

綜上所述，熱處理可以延緩或降低新余蜜橘果實(shí)MDA的積累;提高果實(shí)AsA和GSH含量并延緩AsA和GSH含量在貯藏后期下降速度;增強(qiáng)果實(shí)的活性氧清除酶類SOD、CAT和APX的活性，從而降低過多的活性氧引起的膜功能和結(jié)構(gòu)的破壞，使之能更好地維持細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的區(qū)域化作用和膜結(jié)構(gòu)的完整，延緩果實(shí)的衰老進(jìn)程。此外，SOD、CAT、POD和 APX酶活性的不同變化可能也暗示了貯藏期間新余蜜橘果實(shí)內(nèi)部不同自由基的存在和轉(zhuǎn)化狀態(tài)，這有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過53℃、3 min熱水處理對新余蜜橘采后活性氧代謝調(diào)節(jié)的研究表明:熱處理能夠顯著降低新余蜜橘果實(shí)MDA含量的增加，通過增強(qiáng)果實(shí)抗病信號分子H2O2的積累水平，提高果實(shí)的抗氧化酶SOD、POD和CAT活性和抗氧化物質(zhì)AsA和GSH含量來調(diào)控采后新余蜜橘果皮中活性氧代謝的平衡，使果實(shí)體內(nèi)活性氧保持在一個較低的水平，降低活性氧對其自身的危害，延緩果實(shí)的衰老進(jìn)程。

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