酒花萜烯醇及其立體異構(gòu)體在啤酒釀造中的檢測及其變化研究*

王露，江偉，劉翔，4，王德良，劉玉梅

1(新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊，830046)2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

3(中德發(fā)酵酒品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京，100015)4(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津，300457)

啤酒釀造過程中，酒花是重要原料之一，其中的化學(xué)成分主要包括萜烯類和萜烯醇類［1-3］。其中，親水性較強的萜烯醇(如里那醇、β-香茅醇、α-萜品醇、香葉醇等)，在啤酒中的含量較高［4］，范圍在1～100 μg/L(加拿大精釀啤酒中里那醇含量高達393～906 μg/L［6］)，接近或高于其相應(yīng)的感官閾值［7］，對啤酒酒花香氣具有重要的貢獻［8］。

萜烯醇在麥汁煮沸及發(fā)酵過程會發(fā)生一系列的變化［9］。同時，啤酒中同一種萜烯醇因其不同的分子結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)型而存在不同的感官閾值。以里那醇為例，因其在高品質(zhì)啤酒中的含量高，且香氣宜人，已成為目前公認(rèn)的對啤酒酒花香氣具有重要貢獻的化合物之一，酒花制品中的 R-(-)-里那醇和 S-(+)-里那醇分布穩(wěn)定，R 型占 92% ～94%［10-11］。然而，在啤酒釀造過程中R型異構(gòu)化轉(zhuǎn)變?yōu)镾型，S型在啤酒中的感官閾值高達180 μg/L，而R型僅為2.2 μg/L，二者相差約 81 倍［11］。Steinhaus等強調(diào)，R-(-)-里那醇異構(gòu)化為S-(+)-里那醇是導(dǎo)致啤酒酒花香氣下降的原因之一［12］。除里那醇外，β-香茅醇、α-萜品醇同樣存在立體異構(gòu)體，它們在釀造過程中都伴有異構(gòu)化現(xiàn)象，往往受酒花品種和不同添加工藝等條件的影響。另一方面，同一種物質(zhì)的兩種構(gòu)型可能呈現(xiàn)出的香氣也有細(xì)微差別，如香葉醇呈現(xiàn)類似玫瑰花香及柑橘香，而其順式同分異構(gòu)體橙花醇還具有生青味［13］。一些對酒花香氣貢獻顯著的萜烯醇在啤酒中的閾值如表1所示。

目前，關(guān)于萜烯醇立體異構(gòu)體在啤酒釀造過程中變化規(guī)律的系統(tǒng)研究較少。2000年，King等采用GC-MS法，嘗試?yán)檬中灾蛛x(-)-α-萜品醇、(+)-α-萜品醇及 R-(-)-里那醇、S-(+)-里那醇，α-萜品醇兩種構(gòu)型色譜峰得以完全分離，而里那醇兩種構(gòu)型色譜峰卻難以實現(xiàn)完全分離［16］。2003年，Steinhaus等采用穩(wěn)定同位素稀釋法，通過兩根色譜柱串聯(lián)的方式，利用高分辨率二維HPGC/MS，實現(xiàn)了對啤酒中R-(-)-里那醇、S-(+)-里那醇的分離并在線定量分析［12］。該方法的缺點在于成本較高，操作復(fù)雜，不易向國內(nèi)啤酒企業(yè)推廣普及。本研究采用課題組前期建立的GC-MS分析法，嘗試?yán)靡桓中陨V柱，同時測定啤酒釀造過程中，不同香花添加工藝下(R)-(-)-里那醇、S-(+)-里那醇、(R)-(+)-β-香茅醇、(S)-(-)-β-香茅醇、(+)-α-萜品醇、(-)-α-萜品醇及香葉醇、橙花醇、橙花叔醇、乙酸香茅酯、香葉酸甲酯、乙酸香葉酯，共12種萜烯醇的變化特點，并找出了影響啤酒酒花香氣的4種關(guān)鍵性萜烯醇，初步揭示了啤酒釀造過程中其變化規(guī)律。

表1 萜烯醇風(fēng)味描述及感官閾值Table 1 Olfactory descriptions and sensory thresholds of the terpene alcohols in commercial beer

1 材料與方法

1.1 實驗所用材料

1.1.1 原料

麥芽:澳麥，由國內(nèi)啤酒企業(yè)提供。

酒花:青島大花、薩茲，由國內(nèi)一啤酒企業(yè)提供。

1.1.2 儀器與試劑

100 L微型釀造設(shè)備(D-8050型)，德國聯(lián)邦材料試驗研究院;Clarus 600型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配EI離子源，PerkinElmer;低溫恒溫水浴鍋，杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司;磁力攪拌器，Corning;萬分之一天平，Shimadzu。

里那醇、(R)-(-)-里那醇、α-萜品醇、(+)-α-萜品醇、(R)-(+)-β-香茅醇、(S)-(-)-β-香茅醇、香葉醇、橙花叔醇、橙花醇、乙酸香葉酯、乙酸香茅酯、香葉酸甲酯、2-壬醇(內(nèi)標(biāo))。上述試劑均購自Acros公司和Sigma-Aldrich公司，純度均≥95.0%。

1.2 分析方法

1.2.1 頂空固相微萃取

稱取3 g NaCl于20 mL頂空瓶中，加入發(fā)酵液或除氣啤酒5 mL及內(nèi)標(biāo)溶液(頂空瓶中內(nèi)標(biāo)最終濃度為20 μg/L)，放入磁力攪拌，加蓋密封。將SPME針管穿透頂空瓶隔墊，纖維頭置于距離樣品表面約20 mm的上部空間，在一定的水浴溫度下，以550 r/min攪拌并萃取一段時間后，取出手柄，直接進樣，并解析一定時間。所有樣品均平行測定3次。

1.2.2 色譜條件

色譜柱類型:RESTEK Rt?-bBEXsa。進樣口溫度:240℃。不分流進樣。柱溫:起始溫度50℃，10℃/min升至95℃;3℃/min升至120℃;18℃/min升至210℃，保持10 min。載氣:氦氣(純度≥99.999%)，流速:1 mL/min，進樣方式:采用固相微萃取方式進樣，萃取頭類型為85 μmPA，解析5 min。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源溫度:230℃;傳輸線溫度:230℃;電子轟擊源:70 eV，比對結(jié)果后對酒花香氣化合物進行定性，掃描范圍:29～300 amu。定性采用全掃描模式(SCAN)，定量采用選擇離子掃描模式(SIM)。每個化合物選擇1個定量離子，2～3個定性離子。全離子掃描圖如圖1所示。

圖1 Rt?-bBEXsa對12種酒花香氣及異構(gòu)體的全離子掃描圖Fig.1 Total ion current chromatogram of 12 kinds of hop aroma and stereoisomers scanned by Rt?-bBEXsa

1.2.4 感官品評分析

品評小組由接受過專業(yè)訓(xùn)練的8位品評員組成。

1.3 釀造工藝實驗設(shè)計方案

在100 L的規(guī)模下，參考國內(nèi)13°P純生大生產(chǎn)配料糖化工藝，設(shè)計不同香花添加工藝以考察萜烯醇及其立體異構(gòu)體在發(fā)酵過程中的變化。香花分別選擇在煮沸結(jié)束前10 min、回旋沉淀槽及主酵結(jié)束后添加，其他釀造工藝和條件按國內(nèi)一知名啤酒企業(yè)的正常工藝進行，添加量如表2所示。

表2 不同香花添加工藝實驗設(shè)計Table 2 The experiment design of different hopping regimes

2 結(jié)果與討論

2.1 不同香花添加工藝釀造的啤酒比對研究

2.1.1 不同香花添加工藝中萜烯醇及其立體異構(gòu)體含量對比

表3列出了4種香花添加工藝所釀造的啤酒中萜烯醇及其立體異構(gòu)體的含量。

其中R-(-)-里那醇含量受香花添加工藝影響較大，煮沸結(jié)束、回旋沉淀槽及主酵結(jié)束后添加香花工藝可大幅增加啤酒中R-(-)-里那醇的含量，相比煮沸結(jié)束前10 min工藝提升4.15～6.42倍，其含量相較于其他萜烯醇同樣也占有絕對優(yōu)勢。4種香花添加工藝釀造出的啤酒中里那醇立體異構(gòu)體之間的比例如圖2所示，R-(-)-里那醇占里那醇總量的60% ～89%，含量范圍在1.94 ～14.39 μg/L，按閾值2.2 μg/L［14］可計算出 OAV 值。R-(-)-里那醇在 4種工藝下的OAV值為0.88～6.54，表明R-(-)-里那醇對啤酒酒花香氣具有重要貢獻。煮沸結(jié)束前10 min添加香花工藝中，里那醇R/S構(gòu)型比例最為接近，說明R型異構(gòu)化嚴(yán)重，這將極大的影響啤酒的酒花香氣，導(dǎo)致其品質(zhì)下降。而采用其他3種工藝不僅增加了里那醇含量，而且異構(gòu)化程度明顯降低，R-(-)-里那醇所占比例超過80%，尤其是主酵結(jié)束后添加香花工藝，使R型占總里那醇比例高至89%，OAV值高達6.54，對提高啤酒酒花香氣起到了關(guān)鍵性作用。這種由酒花添加工藝所引起的異構(gòu)化差異與Steinhaus在研究定量里那醇立體異構(gòu)體過程中得到的結(jié)果是一致的［12］。

表3 不同香花添加工藝下啤酒中萜烯醇及其立體異構(gòu)體的含量μg/LTable 3 Content of terpene alcohols(μg/L)of differernt hopping regimes in beer

從表3可以看出，與里那醇相比，啤酒中香葉醇的含量受香花添加工藝的影響較小，說明香葉醇在糖化高溫條件下依舊能夠保留在麥汁當(dāng)中，四種工藝最終保留在啤酒中的含量范圍在9.83 ～12.1 μg/L，按其閾值 6 μg/L［7］計算 OAV 值為 1.64 ～2.02，波動較小，在啤酒中的含量僅次于里那醇，對啤酒酒花香氣具有重要貢獻。

β-香茅醇在酒花中的含量很少，在啤酒釀造過程中大部分由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來。β-香茅醇在麥汁煮沸過程中會發(fā)生異構(gòu)化現(xiàn)象，隨著4種工藝的香花添加時間逐漸推后，啤酒中R-(+)-β-香茅醇含量明顯增多，主酵結(jié)束后添加工藝相比煮沸結(jié)束前10 min工藝增加了1.33倍。4種工藝釀造出的啤酒中β-香茅醇立體異構(gòu)體之間的比例如圖3所示，R-(+)-β-香茅醇在4種工藝中占 β-香茅醇總量的66% ～91%，含量范圍在2.91 ～6.79 μg/L，說明香花添加工藝對R-(+)-β-香茅醇異構(gòu)化影響顯著，尤其是主酵結(jié)束后添加香花工藝，使R型占總β-香茅醇比例高至91%。盡管β-香茅醇OAV值小于1，但對啤酒酒花香氣的貢獻體現(xiàn)在與里那醇、香葉醇的協(xié)同作用［7］，而究竟是R型還是S型更有利于啤酒酒花香氣的提高還有待于進一步研究。

圖2 不同香花添加工藝啤酒中R-(-)-里那醇和S-(+)-里那醇的組成Fig.2 Composition of(R)-(-)and(S)-(+)-Linalool of differernt hopping regimes in beer

圖3 不同香花添加工藝啤酒中S-(-)-β-香茅醇和R-(+)-β-香茅醇的組成Fig.3 Composition of S-(-)and R-(+)-β-citronellol of differernt hopping regimes in beer

啤酒中橙花叔醇在4種香花添加工藝下的變化情況略為反常，煮沸結(jié)束前10 min工藝含量最高，高達6.81 μg/L，說明高溫更利于橙花叔醇在麥汁中的保留，而另外3種香花添加工藝含量范圍在5.34～5.86 μg/L，OAV 值均大于 0.25。

另外，OAV值較低的一些物質(zhì)如:S-(+)-里那醇、(-)-α-萜品醇、(+)-α-萜品醇、S-(-)-β-香茅醇、橙花醇、香葉酸甲酯、乙酸香葉酯、乙酸香茅酯含量范圍在0.01 ～2.8 μg/L，其OAV值小于0.15，說明這些物質(zhì)對啤酒酒花香氣的貢獻不顯著，4種香花添加工藝對其含量的影響也較小，可忽略不計。

綜上所述，R-(-)-里那醇、香葉醇、R-(+)-β-香茅醇、橙花叔醇含量較高且對啤酒酒花香氣具有重要貢獻，其中R-(-)-里那醇、R-(+)-β-香茅醇含量受香花添加工藝影響較大，因此我們將有針對性的對這4種物質(zhì)進行釀造過程中的變化規(guī)律進一步分析研究。

2.1.2 發(fā)酵過程中4種重要的萜烯醇在不同香花添加工藝下的變化規(guī)律

在啤酒發(fā)酵過程中，萜烯醇及其立體異構(gòu)體在酵母的作用下會發(fā)生生物化學(xué)變化，由圖4可知，4種香花添加工藝所釀造的啤酒中，R-(-)-里那醇、香葉醇、R-(+)-β-香茅醇、橙花叔醇的含量均高于其各自在冷麥汁中的含量，國外學(xué)者指出，這些增加的萜烯醇并非自發(fā)產(chǎn)生，也不是完全經(jīng)由酵母自身代謝而成，而是二者共同作用的結(jié)果，即在酵母作用下發(fā)生了相互間的轉(zhuǎn)化［16-17］。

如圖4A所示，當(dāng)采用煮沸結(jié)束前10 min添加香花工藝進行發(fā)酵時，啤酒中R-(-)-里那醇含量不超過2 μg/L，發(fā)酵過程中也沒有明顯的變化趨勢，這是由于高溫使溶解在麥汁中的R-(-)-里那醇大量揮發(fā)，保留下來的量很少，后期通過酵母轉(zhuǎn)化含量略微有所增加。而采用煮沸結(jié)束、回旋沉淀槽工藝添加香花時，冷麥汁中的R-(-)-里那醇含量大幅增加。這兩種工藝變化趨勢基本上相同，發(fā)酵前3天內(nèi)含量不斷地積累，3天后又迅速下降，分別低至5.81 μg/L、7.23 μg/L。下降的原因是由于發(fā)生了生物化學(xué)轉(zhuǎn)化。根據(jù)全巧玲的研究結(jié)果可知，游離的里那醇很快被酵母利用而減少，轉(zhuǎn)化成α-萜品醇，還產(chǎn)生少量香葉醇［18］。第7天后再次回升，最終啤酒中的含量分別為9.99和12.24 μg/L，這可能是由于酵母對糖苷鍵的利用釋放出了部分與糖苷鍵相連的R-(-)-里那醇，使其含量有所回升［19-20］。與冷麥汁相比，這兩種工藝釀造的啤酒中，R-(-)-里那醇含量分別上升45%、35%。而采用主酵結(jié)束后添加香花工藝，情況又有所不同。添加香花之前，該工藝發(fā)酵液與煮沸結(jié)束前10 min添加香花工藝中R-(-)-里那醇的含量基本持平，而主酵結(jié)束(第7天)添加香花后，R-(-)-里那醇含量快速增加，后酵期繼續(xù)小幅增長使得最終保留在啤酒中的含量高達13.79 μg/L，是該工藝下冷麥汁中含量的10.1倍，說明避開了高溫的作用下，酒花中的R-(-)-里那醇能夠直接溶解于發(fā)酵液中，同時也說明酒花中的R-(-)-里那醇含量很高。JP

如圖4B所示，香葉醇與R-(-)-里那醇的變化趨勢較為相似。不同之處在于，采用煮沸結(jié)束和回旋沉淀槽添加香花工藝時，雖然發(fā)酵前3天香葉醇保留在發(fā)酵液中的含量明顯高于煮沸結(jié)束前10 min添加工藝，但是發(fā)酵第3天后，這3種工藝條件下的香葉醇含量都開始大幅下降，降至8.30±0.3 μg/L，根據(jù)King和Dickinson［13-16］繪制的酵母作用下萜醇轉(zhuǎn)化路徑圖可知，香葉醇可以轉(zhuǎn)化為β-香茅醇和里那醇。然而，從第7天起，發(fā)酵液主酵結(jié)束，香葉醇由于某種原因含量又開始回升，部分來自于里那醇的轉(zhuǎn)化［18］。觀察主酵結(jié)束后香花添加工藝下香葉醇在冷麥汁中的含量可知，此時保留在冷麥汁中的香葉醇完全由苦花賦予，其在高溫糖化作用下仍能大量存在，含量高達5.67 μg/L，是此工藝條件下冷麥汁中R-(-)-里那醇含量的4.12倍，說明香葉醇比R-(-)-里那醇在高溫條件能更穩(wěn)定地保留在麥汁當(dāng)中，還有一種可能是由于青島大花本身所含有的香葉醇含量很高所致。有學(xué)者們認(rèn)為，香葉醇的含量比里那醇更具有酒花品種特異性［6，21］(即不同的酒花品種，香葉醇含量相差較大)。

對比圖4C四種工藝可知，R-(+)-β-香茅醇在冷麥汁中的含量很少，均不超過1 μg/L，隨著發(fā)酵的進行，前3天內(nèi)R-(+)-β-香茅醇含量有明顯增加，這與發(fā)酵液中香葉醇的轉(zhuǎn)化有一定關(guān)聯(lián)。發(fā)酵3天后，回旋沉淀槽和煮沸結(jié)束添加香花工藝R-(+)-β-香茅醇含量不斷下降，根據(jù)全巧玲的研究可知，它們部分轉(zhuǎn)化成為了乙酸香茅酯，以及少量香葉醇［18］。而值得關(guān)注的是主酵結(jié)束后添加香花工藝，添加香花后R-(+)-β-香茅醇在發(fā)酵液中的含量并沒有大幅度增長，而是繼續(xù)緩緩上升，證明了酒花中R-(+)-β-香茅醇含量較少，含量的增加是由于其他物質(zhì)的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化作用，一直到發(fā)酵結(jié)束，含量達到6.79 μg/L。Takoi等研究表明，β-香茅醇含量在發(fā)酵后期的含量增加并非是簡單的香葉醇含量迅速下降直接轉(zhuǎn)化而來的結(jié)果，這其中可能還存在一些尚不明確的途徑［7］，4種香花添加工藝在主酵結(jié)束后(第七天)R-(+)-β-香茅醇含量均緩慢增加，據(jù)文獻記載，Lager酵母在發(fā)酵后期細(xì)胞膜的通透性增加，外切1，4-糖苷酶被分泌到細(xì)胞外，糖苷酶可以將部分結(jié)合態(tài)存在的萜烯醇水解成相應(yīng)的游離態(tài)［17，22］，從而可能促使R-(+)-β-香茅醇含量增加。

圖4 發(fā)酵過程中不同香花添加工藝下4種萜烯醇的含量變化(μg/L)Fig.4 Comparison of four terpene alcohols(μg/L)during fermentation of differernt hopping regimes in beer

如圖4D所示，橙花叔醇在4種香花添加工藝下的變化趨勢基本一致，而較為反常的是，發(fā)酵進行到第3天時，主酵結(jié)束后添加香花工藝的橙花叔醇含量略高于其他3種已添加了香花的工藝。而主酵結(jié)束后(第7天)添加了香花，該工藝卻并沒有因為新添加了香花使橙花叔醇的含量再度增加，這可能是由于酒花本身所含有的橙花叔醇含量就很低所致。直到發(fā)酵液主酵結(jié)束，四種工藝中橙花叔醇含量基本一致，均高于 5 μg/L。

綜上所述，R-(-)-里那醇、R-(+)-β-香茅醇、香葉醇在主酵結(jié)束后添加香花工藝條件下，含量均最高，相較于煮沸結(jié)束前10 min添加香花工藝分別提高6.42、0.19、1.33倍，其次是回旋沉淀槽添加香花工藝，煮沸結(jié)束和煮沸結(jié)束前10 min添加香花工藝含量相對較低。而橙花叔醇在煮沸結(jié)束前10 min添加香花工藝中含量最高，而主酵結(jié)束后、煮沸結(jié)束、回旋沉淀槽添加香花工藝含量較低且相差不顯著。

2.2 感官品評

香花添加工藝對啤酒中的萜烯醇及其立體異構(gòu)體含量影響較大，結(jié)合感官品評方式對啤酒做出評價，并對香氣進行描述，可確定出最佳的香花添加工藝。圖5給出了品評小組針對5種香氣(花香、柑橘香、生青味、酒花味、苦味)及協(xié)調(diào)性的綜合評分。

煮沸結(jié)束前10 min添加香花工藝感官評分?jǐn)?shù)各項都較低，酒花香氣不明顯，整體協(xié)調(diào)性也欠佳。另外3種工藝評分較高，且分?jǐn)?shù)較為接近。綜合得分最高的是回旋沉淀槽添加香花工藝，其中R-(-)-里那醇、香葉醇、R-(+)-β-香茅醇含量均較高，以該工藝添加香花，可能有助于其累加協(xié)同作用，使釀造出的啤酒香氣明顯，富含花香及典型柑橘香，整體協(xié)調(diào)性最佳。采用主酵結(jié)束后添加香花工藝，使萜烯醇及其立體異構(gòu)體最大程度的保留在麥汁當(dāng)中，但生青味較為明顯，這可能與R-(+)-β-香茅醇含量過高有關(guān)。本研究在測定酒花香氣閾值時，品評小組普遍反映:當(dāng) R-(+)-β-香茅醇含量在 8 μg/L 左右，會給啤酒帶來香氣的同時，加重啤酒的生青味及苦澀感，采用主酵結(jié)束后添加香花工藝時R-(+)-β-香茅醇含量達6.79 μg/L，使得整體的協(xié)調(diào)性受到了影響。因此，本研究香氣綜合評分中，4種工藝效果由高到低分別為回旋沉淀槽＞主酵結(jié)束后＞煮沸結(jié)束＞煮沸結(jié)束前10 min(試驗前3者差異較小)。

圖5 不同香花添加工藝釀造的啤酒感官風(fēng)味輪廓Fig.5 Flavour profile of sensory evaluation of differernt hopping regimes in beer

3 結(jié)論

本文采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)(HS-SPME/GC-MS)，跟蹤檢測了啤酒釀造過程中源自酒花的12種香氣物質(zhì)，包括(R)-(-)-里那醇、S-(+)-里那醇、(R)-(+)-β-香茅醇、(S)-(-)-β-香茅醇、(+)-α-萜品醇、(-)-α-萜品醇及香葉醇、橙花醇、橙花叔醇、乙酸香茅酯、香葉酸甲酯、乙酸香葉酯，對比研究不同的香花添加工藝，發(fā)現(xiàn)R-(-)-里那醇、香葉醇、R-(+)-β-香茅醇、橙花叔醇含量較高且對啤酒酒花香氣具有重要貢獻，它們在4種工藝下釀造的啤酒中含量最高分別可達14.39 μg/L、12.10 μg/L、6.79 μg/L、6.81 μg/L，OAV 值范圍在 0.29 ～6.54。前3者在主酵結(jié)束后添加香花工藝中含量最高，其次是回旋沉淀槽添加香花工藝。而高溫更利于橙花叔醇在麥汁中的保留，煮沸結(jié)束前10 min添加香花工藝中其含量最高。4種重要的萜烯醇在發(fā)酵過程中，受不同香花添加工藝影響下遵循一定的變化規(guī)律。

將檢測結(jié)果和感官評品結(jié)合對4種香花添加方式進行對比，發(fā)現(xiàn)4種工藝效果由高到低分別為:回旋沉淀槽＞主酵結(jié)束后＞煮沸結(jié)束＞煮沸結(jié)束前10 min，回旋沉淀槽添加香花工藝綜合得分最高，使啤酒富含酒花香氣，該工藝更有利于提高國產(chǎn)啤酒酒花香氣，打造具有典型酒花香氣的優(yōu)質(zhì)啤酒。

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