大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體的制備及穩(wěn)定性研究

廖振宇，汪曉冬，高亦軍

（天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測技術研究院，天津300384）

大蒜（Allium sativum L）為百合科蔥屬植物的鱗莖，營養(yǎng)豐富，是日常生活中常用的香辛蔬菜和調(diào)味佳品，而且具有很強的防病治病保健功能，歷來被視為藥食兼用佳品[1]。近年來，國內(nèi)外許多研究人員從大蒜中提取出多糖成分，并逐步發(fā)現(xiàn)大蒜多糖具有抗菌消炎、抗血凝、降血脂和防止動脈粥樣硬化的功效，同時還有抗尿糖、保護肝功能、抗腫瘤和預防衰老等作用[2-4]。然而，大蒜多糖不能被小腸黏膜細胞吸收進入血液，而且在體內(nèi)易被酸、堿或酶破壞，導致大蒜多糖生物活性失活，在體內(nèi)不能起到預期的治療效果，因此，有必要采取措施改善其在人體內(nèi)的療效[5]。

脂質(zhì)體（1iposome）最早是1965年由Bangham等作為生物膜的模型提出的[6]。脂質(zhì)體技術首先應用在藥物載體領域。近年來，脂質(zhì)體在食品工業(yè)中顯示出較為廣闊的應用空間，可用于生產(chǎn)微膠囊化的酶制劑、保護維生素在加工過程的損失、用于香精香料的包裹等[7-9]。同時，采用聚乙二醇（PEG）及其脂質(zhì)衍生物修飾脂質(zhì)體的研究受到廣泛關注，并取得很大進展。由于經(jīng)PEG修飾后的脂質(zhì)體表面親水性增加，降低了其與吞噬細胞的親和性，因而能逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的識別而減少其對脂質(zhì)體的捕獲，延長體內(nèi)循環(huán)時間[10]。因此，為提高大蒜多糖的生物利用率，穩(wěn)定性和療效，將其制備成長循環(huán)納米脂質(zhì)體材料。本實驗以PEG2000作為修飾脂質(zhì)體膜材，采用薄膜分散法制備大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體，并對其在體外穩(wěn)定性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜多糖：天津科技大學食品安全實驗室饋贈；卵磷脂（大豆）：上海伯奧生物科技有限公司；膽固醇、Triton X-100：天津市光復精細化工研究所；聚乙二醇（MW：2000）：天津市天正化學試劑廠；標準葡萄糖溶液（質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL）和蒽酮（質(zhì)量濃度為2 mg/mL）：均為天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測技術研究院食品檢驗室自配得到。

1.2 儀器與設備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；BI-90Plus激光粒度儀/Zeta電位儀：美國布魯克-海文公司；JEOL-100CXII型透射電子顯微鏡：日本電子光學公司；UV-9100型紫外可見光分光光度計：北京瑞利分析儀器廠；萬分之一天平BS110：北京賽多利天平有限公司；PHB-4型pH計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大蒜多糖脂質(zhì)體溶液制備

采用薄膜分散法[11]制備大蒜多糖脂質(zhì)體的過程如下：精確稱取適量大豆卵磷脂和膽固醇（質(zhì)量比例為2∶1），加入到50 mL茄形瓶中，溶于一定量的乙醚中，然后在35℃下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以50 r/min的旋轉(zhuǎn)速度進行旋蒸，同時向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。當茄形瓶中形成一層透明均勻的脂質(zhì)膜后，繼續(xù)旋蒸30 min，之后將茄形瓶取下，向茄形瓶中加入含PEG2000和大蒜多糖的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.2）適量，將脂質(zhì)膜水化，然后用超聲波清洗器以60 W的功率進行超聲分散，直至形成半透明乳液，通過內(nèi)徑0.8 μm微孔濾膜后，即得大蒜多糖脂質(zhì)體。

1.3.2 大蒜多糖脂質(zhì)體形態(tài)學觀察

將上述脂質(zhì)體混懸液用透射電子顯微鏡進行觀察，透射電子顯微鏡采用磷鎢酸負染法進行，用微量取樣器將大蒜多糖脂質(zhì)體溶液滴加到銅網(wǎng)上，靜置過夜后透射電鏡下觀察其微觀形貌。

1.3.3 粒徑和粒度分布研究

取上述脂質(zhì)體混懸液樣品適當稀釋進行超聲分散，然后將液體樣品加入專用的測試皿中，用BI-90Plus激光粒度儀/Zeta電位儀測試分析樣品的粒徑。

1.3.4 大蒜多糖含量分析

采用蒽酮-硫酸法測定大蒜多糖含量，原理為多糖在濃硫酸的作用下可脫水生成糖醛衍生物，后者再與蒽酮作用形成藍色化合物，與同法處理的標準葡萄糖溶液比色定量。具體如下：分別吸取標準葡萄糖溶液 0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0 mL，置于具塞比色管中，用蒸餾水稀釋至1.0 mL，搖勻。然后分別加入蒽酮試劑4.0 mL，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋，以防蒸發(fā)。自水浴沸騰起計時，準確煮沸10 min，取出，用冰浴冷卻至室溫，于波長620 nm測吸光度，以1.0 mL水按同樣操作作為空白，以葡萄糖濃度C為橫坐標，吸光度值A為縱坐標，制得葡萄糖標準曲線。

樣品液的制備：分別配成濃度為10 mg/mL的大蒜多糖。

測定：吸取1 mL已稀釋的大蒜多糖于試管中，加入4.0 mL蒽酮試劑，平行3份；空白管以等量蒸餾水替代大蒜多糖。以下操作同標準曲線制作。根據(jù)平均值在標準曲線上查出葡萄糖的含量（μg），由此可得到多糖的含量。

1.3.5 脂質(zhì)體包封率的測定方法

取10 mL大蒜多糖脂質(zhì)體在 7000 r/min離心20 min，把上層清液去掉，用磷酸鹽緩沖液定容至10 mL，再以 7000 r/min離心20 min，去掉上層清液，加Triton X- 1005%乙醇溶液2 mL破乳，用上述方法測定脂質(zhì)體內(nèi)包裹大蒜多糖的含量。

脂質(zhì)體包封率計算公式為：

1.3.6 大蒜多糖脂質(zhì)體穩(wěn)定性初步研究

觀察大蒜多糖脂質(zhì)體混懸液在不同溫度、不同儲存時間等條件下對其泄漏率和粒度的影響。

2 結果與分析

2.1 大蒜多糖脂質(zhì)體形態(tài)學觀察

在透射電鏡下觀察，大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體分布均勻、顆粒間彼此分散較好、獨立、連續(xù)呈圓形或橢圓形微球體（見圖1）。

2.2 粒徑和粒度分布的檢測結果

大蒜多糖脂質(zhì)體的平均粒徑為115.4 nm，粒徑分布見圖2。

脂質(zhì)體的粒徑較小，多分散指數(shù)為0.308，說明其分布均勻。

2.3 葡萄糖標準曲線

本實驗采用蒽酮-硫酸法測定大蒜多糖含量，見圖3。

圖2 大蒜多糖脂質(zhì)體粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of garlic polysaccharide liposomes

圖3 葡萄糖的標準曲線Fig.3 Standard curve of glucose

葡萄糖標準曲線顯示，以吸收度A620對葡萄糖濃度作回歸曲線得：Y=0.037x+0. 0039，r=0． 9991，表明葡萄糖在2 μg/mL～20 μg/mL的濃度范圍之間與吸光度呈良好的線性關系。

2.4 包封率的測定

本實驗用Triton X- 1005%乙醇溶液破壞脂質(zhì)體雙層膜，測定長循環(huán)脂質(zhì)體中被包封的大蒜多糖含量，計算脂質(zhì)體的包封率。通過計算分析，大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體的平均包封率為71.94%，普通脂質(zhì)體的包封率為59.23%，說明經(jīng)PEG包覆的脂質(zhì)體的包封率明顯高于無PEG修飾的普通大蒜多糖脂質(zhì)體，這可能由于PEG具有一定的柔性，可交錯重疊覆蓋在脂質(zhì)體的表面，形成致密的構像云，從而起到穩(wěn)定脂質(zhì)體的作用。

2.5 大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性考察

大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性考察指標有很多，本文選擇外觀、粒徑、泄漏率指標來考察其穩(wěn)定性，基本上能反映脂質(zhì)體的穩(wěn)定性變化結果見圖4、圖5。

圖4 保存時間和溫度對大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體泄漏率的影響Fig.4 Effects of storage time and temperature on the leakage rate of liposomes

圖5 保存時間和溫度對大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體粒徑的影響Fig.5 Effects of storage time and temperature on the particle size distribution of liposomes

由圖4可知，脂質(zhì)體的泄漏率隨保存時間的延長逐漸增大；隨著溫度的升高，泄漏率都隨之增加。從圖5可知，脂質(zhì)體的粒徑隨保存時間的延長逐漸增大；隨著溫度的升高，粒徑也隨之增加，但泄漏率和粒徑在調(diào)查的時間和溫度范圍內(nèi)沒有大幅度增加，均在可接受的合理范圍內(nèi)，說明大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性。

3 結論

國內(nèi)外有不少有關大蒜多糖的提取純化工藝和生物活性等方面的研究報道。但很少有報道將大蒜多糖制備成脂質(zhì)體以改善其生物利用率和療效。常用制備脂質(zhì)體的方法有逆相蒸發(fā)法、超聲波分散法、冷凍干燥法、薄膜分散法、膜擠壓法、注入法等。本實驗選擇薄膜分散法制備脂質(zhì)體，是基于該方法操作簡單、條件溫和、適合于生物大分子脂質(zhì)體的制備。實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)聚乙二醇（PEG）修飾的長循環(huán)脂質(zhì)體形態(tài)圓整、分散均勻，平均粒徑為115.4 nm，對大蒜多糖的包封率為71.94%，明顯高于普通脂質(zhì)體的包封率，說明PEG包覆脂質(zhì)體有利于提高包封率，更好地控制藥物釋放和靶向性，延長在體內(nèi)循環(huán)時間。本實驗制備的納米脂質(zhì)體在設計的保存時間和溫度范圍下具有較好的穩(wěn)定性，對脂質(zhì)體的滲漏率和粒徑變化的影響均在可接受的范圍內(nèi)。

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