封閉式負(fù)壓吸引治療中不同負(fù)壓模式對(duì)療效影響實(shí)驗(yàn)研究＊

西安市中心醫(yī)院燒傷整形外科 （西安710003） 郝 劍 劉 賓 汪 陽(yáng) 陶 諫 田 萍

負(fù)壓 創(chuàng) 面 治 療 技 術(shù) （Negative pressure wound therapy，NPWT）是一種促進(jìn)創(chuàng)面愈合的醫(yī)療技術(shù)。該技術(shù)是將吸引裝置與特殊的傷口敷料連接后，使傷口保持在負(fù)壓狀態(tài)，可以改善創(chuàng)面微循環(huán)，促進(jìn)創(chuàng)面肉芽生長(zhǎng)，減少細(xì)菌定植和繁殖，保持傷口環(huán)境濕潤(rùn)，從而達(dá)到治療創(chuàng)面的目的。封閉式負(fù)壓吸引技術(shù)可分為持續(xù)性負(fù)壓吸引、間斷式負(fù)壓吸引以及變壓式負(fù)壓吸引，而目前臨床上對(duì)于應(yīng)用該技術(shù)治療慢性創(chuàng)面時(shí)負(fù)壓模式的選擇沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)。我們通過(guò)初步的實(shí)驗(yàn)，探索應(yīng)用封閉式負(fù)壓引流技術(shù)治療慢性創(chuàng)面時(shí)的較為合理的負(fù)壓治療模式，為該技術(shù)在臨床創(chuàng)面治療領(lǐng)域更廣泛的應(yīng)用打下良好的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材 料 封閉式負(fù)壓吸引裝置及敷料（武漢維斯第公司）。構(gòu)建兔耳慢性創(chuàng)面模型：健康CL級(jí)新西蘭大耳白兔24只，48～60月齡（老齡兔），體重3．9～5．0kg。30g／L戊巴比妥鈉1．5ml／kg耳緣靜脈麻醉，多普勒血流儀測(cè)定兔耳背側(cè)動(dòng)靜脈走向及分布，從根部向遠(yuǎn)端分段結(jié)扎兔耳中央動(dòng)脈及頭側(cè)動(dòng)靜脈，結(jié)扎后血管呈紫黑色，在耳根部切開(kāi)皮膚，切斷中央動(dòng)脈及頭側(cè)動(dòng)靜脈，保留尾側(cè)靜脈及周圍皮膚約0．5cm，將軟骨膜掀開(kāi)并向兩側(cè)分離約0．5cm，去除游離的軟骨膜，縫合皮膚。用手術(shù)刀在耳腹側(cè)制5cm×2cm的長(zhǎng)方形創(chuàng)面，刮除軟骨膜，暴露軟骨。以明膠海棉薄片蘸取0．9%生理鹽水覆于每個(gè)創(chuàng)面 外層覆蓋無(wú)菌密封薄膜。為維持缺血狀態(tài)，于術(shù)后3d、6d、9d和12d在兔耳根部多次行環(huán)扎手術(shù)，直至軟骨表面形成穩(wěn)定創(chuàng)面。

2 方 法

2．1 分組：將入選兔耳慢性創(chuàng)面模型隨機(jī)分為三組，每組8只16例創(chuàng)面，第一組為持續(xù)性負(fù)壓吸引組，第二組為間斷性負(fù)壓吸引組，第三組為變壓性負(fù)壓吸引組。創(chuàng)面及創(chuàng)周用生理鹽水和氯己定（1∶1000）清洗后，按創(chuàng)面大小修剪多孔藻酸鹽敷料，置入創(chuàng)面至創(chuàng)緣，引流管由創(chuàng)緣直接引出，透明貼膜封閉整個(gè)創(chuàng)面。將引流管通過(guò)連接管連于負(fù)壓終端，持續(xù)負(fù)壓吸引組負(fù)壓參數(shù)120mmHg，間斷負(fù)壓吸引組負(fù)壓參數(shù)為0mmHg及120mmHg，變壓負(fù)壓吸引組負(fù)壓參數(shù)為10～120mmHg。在三種壓力治療模式下分別對(duì)兔耳慢性創(chuàng)面進(jìn)負(fù)壓吸引治療。

2．2 創(chuàng)面大體觀察：將上述三治療組分別于負(fù)壓下處理24、48、72h后更換創(chuàng)面藻酸鹽敷料，觀察創(chuàng)面的滲出、異味以及肉芽組織生長(zhǎng)情況。在治療前及每個(gè)治療時(shí)間點(diǎn)分別于創(chuàng)緣切取2mm×2mm×2mm大小的組織塊及創(chuàng)緣正常皮膚行后續(xù)組織學(xué)檢查。

2．3 創(chuàng)面收縮測(cè)量：分別于負(fù)壓持續(xù)處理24、48、72h測(cè)量各組創(chuàng)面的長(zhǎng)度及寬度，計(jì)算創(chuàng)面收縮率［1］。

2．4 細(xì)胞周期測(cè)定：活檢組織生理鹽水清洗后，置于5ml Dispase液中，37℃，2h。分離表皮（刮除方法），加入0．1g／L的胰蛋白酶5ml，吹打3～5min，取上清。200目濾網(wǎng)過(guò)濾，取濾液，加入50ml／L小牛血清離心（1000r／min，10min）。棄上清，加入 DMEM 5ml，輕輕吹打后同法離心2次，去除小碎片。棄上清，加入PBS 1ml，輕輕吹打，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至（1～2）×106。將細(xì)胞懸液加入2ml 4%酒精中固定，封口，4℃保存。固定的細(xì)胞懸液用PBS離心洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106，加入PI染液1ml，4℃冰箱避光染色30min，流式細(xì)胞儀測(cè)定分析細(xì)胞周期。

2．5 免疫組化SABC法檢測(cè)細(xì)胞核增殖抗原（PCNA）：參照Boster公司產(chǎn)品使用說(shuō)明操作。15μm石蠟切片，二甲苯脫蠟，甲醇－30ml／L 過(guò)氧化氫，30min，PBS 清 洗 5min×3 次，50ml／L 兔 抗 血 清30min，PCNA單抗（1∶200）室溫過(guò)夜，PBS清洗5min×3次，羊抗兔血清（1∶200），室溫30min，SABC室溫下30min。PBS清洗5min×3次，DAB顯色，脫水、透明，封片，觀察。以0．01mol／L的PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：400倍光鏡下觀察記錄5個(gè)視野內(nèi)平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于5個(gè)計(jì)為（－），5～10個(gè)計(jì)為（＋），10個(gè)以上計(jì)為（?），大于半數(shù)計(jì)為（?）。

2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS11．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組織學(xué)及免疫組化結(jié)果按等級(jí)資料分析；細(xì)胞周期測(cè)定值作成組t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)作t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 創(chuàng)面大體觀察結(jié)果 24h：持續(xù)負(fù)壓組、間斷負(fù)壓及變壓負(fù)壓三組均引流通暢、創(chuàng)面分泌物減少、創(chuàng)面出現(xiàn)收縮；48h：三組均引流通暢，創(chuàng)面分泌物減少，持續(xù)負(fù)壓組創(chuàng)面縮小無(wú)明顯變化，間斷及變壓兩組創(chuàng)面持續(xù)縮小；72h：三組均引流通暢、其中變壓治療組肉芽組織鮮紅并均勻擴(kuò)大；持續(xù)負(fù)壓吸引組肉芽組織散在，分布不均勻，間斷負(fù)壓治療組肉芽組織生長(zhǎng)情況介于二者之間。

2 創(chuàng)面收縮率 經(jīng)過(guò)負(fù)壓吸引治療的各組創(chuàng)面均出現(xiàn)明顯收縮，其中持續(xù)負(fù)壓吸引組創(chuàng)面持續(xù)收縮72h，但創(chuàng)面面積縮小不明顯。間斷負(fù)壓吸引組和變壓負(fù)壓吸引組負(fù)壓治療開(kāi)始后也出現(xiàn)明顯創(chuàng)面收縮，且隨治療時(shí)間延長(zhǎng)創(chuàng)面面積出現(xiàn)逐漸縮?。ǜ綀D）。

3 細(xì)胞周期測(cè)定 正常皮膚組織細(xì)胞以G0／G1期為主，S期及G2＋M期細(xì)胞比例較小。治療后24h及48h，持續(xù)負(fù)壓吸引組S期及G2＋M期細(xì)胞均與創(chuàng)緣正常皮膚基本相同，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著性差異（P＞0．05）；治療48h間斷負(fù)壓及變壓負(fù)壓吸引組S期及G2＋M期細(xì)胞出現(xiàn)增多（P＜0．05）；治療后72h，三組S期及G2＋M期細(xì)胞均較正常皮膚組明顯增多 （P＜0．05）。這表明：負(fù)壓治療的早期（24h之內(nèi)）創(chuàng)面未出現(xiàn)明顯的上皮細(xì)胞增生；間斷負(fù)壓和變壓治療較持續(xù)負(fù)壓能夠更早的誘導(dǎo)組織細(xì)胞增生，見(jiàn)表1。

附圖 三種負(fù)壓模式不同治療時(shí)間創(chuàng)面面積收縮率

表1 正常皮膚與不同負(fù)壓模式處理組創(chuàng)面細(xì)胞周期變化（±s）

表1 正常皮膚與不同負(fù)壓模式處理組創(chuàng)面細(xì)胞周期變化（±s）

24h 48h 72h細(xì)胞周期 正常皮膚80．23±8．34 77．41±8．47 76．27±7．89 S 7．58±3．58 8．08±3．43 8．12±3．28 7．41±3．26 7．62±3．48 14．18±4．27 15．67±5．19 15．31±4．79 16．97±5．14 17．36±5．09 G2＋M 1．24±1．16 1．91±1．12 1．90±1．09 1．37±1．03 1．95±1．04 4．59±2．36 4．86±2．29持續(xù)負(fù)壓 間斷負(fù)壓 變壓負(fù)壓G0／G191．18±8．03 90．01±8．24 89．98±8．17 91．22±8．35 90．43±8．37 81．23±7．65 79．47±8．54持續(xù)負(fù)壓 間斷負(fù)壓 變壓負(fù)壓 持續(xù)負(fù)壓 間斷負(fù)壓 變壓負(fù)壓4．46±1．99 5．52±2．18 6．37±1．96

治療24h三組S期及G2＋M期細(xì)胞與正常皮膚組比較無(wú)顯著差異（P＞0．05）；治療48h間斷負(fù)壓，變壓負(fù)壓兩組S期及G2＋M期細(xì)胞與正常皮膚組比較，有顯著性差異（P＜0．05）；持續(xù)負(fù)壓組S期及G2＋M期細(xì)胞與正常皮膚組比較，無(wú)顯著性差異（P＞0．05）；治療72h三組S期及G2＋M期細(xì)胞與正常皮膚組比較，有顯著性差異（P＜0．05）。

4 PCNA表達(dá)改變 正常皮膚組織中細(xì)胞核增殖抗原（PCNA）表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞主要是皮膚基底細(xì)胞，表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及毛囊上皮細(xì)胞PCNA均為陰性。治療24h，持續(xù)負(fù)壓、間斷負(fù)壓及變壓負(fù)壓三組創(chuàng)面組織中皮膚基底細(xì)胞，表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及毛囊上皮細(xì)胞PCNA均為陰性，表明在負(fù)壓治療的早期（24h內(nèi)），創(chuàng)面沒(méi)有出現(xiàn)明顯的組織細(xì)胞增殖；治療48h，變壓負(fù)壓及間斷負(fù)壓治療組，成纖維細(xì)胞及毛囊上皮細(xì)胞PCNA出現(xiàn)陽(yáng)性，持續(xù)負(fù)壓組為陰性；治療72h，變壓負(fù)壓及間斷負(fù)壓治療組，成纖維細(xì)胞及毛囊上皮細(xì)胞PCNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，而成纖維細(xì)胞更為明顯；持續(xù)負(fù)壓治療組三種細(xì)胞PCNA表達(dá)均出現(xiàn)陽(yáng)性，此結(jié)果提示間斷負(fù)壓及變壓負(fù)壓治療可能較早的誘發(fā)創(chuàng)面組織細(xì)胞的增殖，見(jiàn)表2。

治療24h：三負(fù)壓處理組中三類細(xì)胞PCNA表達(dá)水平與正常皮膚組比較，無(wú)顯著性差異（P＞0．05）；治療48h：間斷負(fù)壓與變壓負(fù)壓中成纖維與毛囊細(xì)胞PCNA表達(dá)水平與正常皮膚組比較，有顯著性差異（P＜0．05）；治療72h：持續(xù)負(fù)壓、間斷負(fù)壓、變壓負(fù)壓三組中成纖維與毛囊細(xì)胞PCNA表達(dá)水平與正常皮膚組比較，有顯著性差異（P＜0．05）。

表2 正常皮膚與不同負(fù)壓處理組創(chuàng)面PCNA表達(dá)水平（±s）

表2 正常皮膚與不同負(fù)壓處理組創(chuàng)面PCNA表達(dá)水平（±s）

24h 48h 72h分組 正常皮膚持續(xù)負(fù)壓 間斷負(fù)壓 變壓負(fù)壓基底細(xì)胞 ＋～? ／ ／ ／ ／ ／ －～＋ －～＋ －～＋ －～＋持續(xù)負(fù)壓 間斷負(fù)壓 變壓負(fù)壓 持續(xù)負(fù)壓 間斷負(fù)壓 變壓負(fù)壓成纖維細(xì)胞 — — — — — ＋～? ＋～? －＋～? ?～? ?～?毛囊上皮細(xì)胞 — — — — — ＋ ＋ ＋～? ＋～? ＋～?

討 論

作為近幾年來(lái)興起的一種促進(jìn)創(chuàng)面愈合的技術(shù)，封閉式負(fù)壓吸引為慢性創(chuàng)面的處理及治療提供了一種良好的選擇［2，3］。封閉式負(fù)壓吸引技術(shù)為創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)提供了一個(gè)相對(duì)封閉、潮濕及無(wú)菌的環(huán)境，它可促進(jìn)創(chuàng)面的血液微循環(huán)及肉芽組織生長(zhǎng)，降低換藥所帶來(lái)的創(chuàng)面疼痛。國(guó)內(nèi)外學(xué)者將負(fù)壓創(chuàng)面治療技術(shù)應(yīng)用于多種急、慢性創(chuàng)面的治療或促進(jìn)移植皮膚、皮瓣的成活，均取得了良好的效果［4］。

目前，臨床上負(fù)壓吸引治療所用的壓力模式多為持續(xù)性恒定壓力，這種治療模式的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單方便、易于推廣，在有中心負(fù)壓病房的臨床科室很容易開(kāi)展。然而歐美負(fù)壓創(chuàng)傷治療學(xué)會(huì)的基礎(chǔ)理論研究顯示，在一定范圍的負(fù)壓下，間斷壓力或者變化壓力的吸引方法，更加符合創(chuàng)面修復(fù)的病理循環(huán)周期，有利于細(xì)胞的有絲分裂和蛋白合成以及各種組織再生和肉芽生長(zhǎng)，加速創(chuàng)傷愈合過(guò)程［5］。因此我們將三種負(fù)壓模式作用于兔耳慢性創(chuàng)面模型，通過(guò)對(duì)各種壓力模式下不同時(shí)間創(chuàng)面大體外觀、收縮率、細(xì)胞周期及細(xì)胞核增殖抗原表達(dá)的測(cè)定與分析，探討間斷性負(fù)壓以及變壓性負(fù)壓這兩種不同負(fù)壓治療模式在臨床應(yīng)用的可行性。

通過(guò)對(duì)三種負(fù)壓模式處理后創(chuàng)面外觀的觀察發(fā)現(xiàn)：三種壓力模式在72h左右均可以達(dá)到誘導(dǎo)肉芽組織生長(zhǎng)、通暢引流及促進(jìn)創(chuàng)面收縮的治療效果。而間斷負(fù)壓以及變壓負(fù)壓在促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)及創(chuàng)面收縮方面的效果更加明顯。持續(xù)負(fù)壓吸引可以立即誘發(fā)創(chuàng)面的收縮，且在整個(gè)治療的過(guò)程保持不變。間斷負(fù)壓以及變壓負(fù)壓在治療的開(kāi)始也立刻出現(xiàn)創(chuàng)面的收縮，但與持續(xù)負(fù)壓吸引不同的是，這種收縮是逐漸增加的，也就是說(shuō)，傷口面積在逐漸減。因此在治療72h后，我們可以發(fā)現(xiàn)間斷負(fù)壓及變壓負(fù)壓組的創(chuàng)面面積明顯較持續(xù)負(fù)壓組變小。這種差異的可能原因是由于間斷負(fù)壓及變壓負(fù)壓的按摩效果，刺激創(chuàng)面邊緣組織的細(xì)胞骨架重構(gòu)、導(dǎo)致信號(hào)Cascade及生長(zhǎng)因子釋放，促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂以及組織生長(zhǎng)［6，7］。

通過(guò)應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組樣本組織細(xì)胞DNA含量，計(jì)算出各期細(xì)胞所占比例，發(fā)現(xiàn)三種負(fù)壓模式處理創(chuàng)面在24hS期及G2＋M期細(xì)胞較正常皮膚均未明顯增多；48h間斷及變壓負(fù)壓治療組S期及G2＋M期細(xì)胞出現(xiàn)增多；72h三組創(chuàng)面S期及G2＋M期細(xì)胞均明顯增多；提示組織細(xì)胞增殖活躍，創(chuàng)面進(jìn)入修復(fù)狀態(tài)在傳統(tǒng)的持續(xù)性負(fù)壓吸引治療中開(kāi)始于治療后72h而通過(guò)改變負(fù)壓吸引模式為間斷性或變壓性，則有能將這一修復(fù)開(kāi)始時(shí)間提前至治療開(kāi)始后48h。

正常情況下，PCNA存在于部分皮膚基底細(xì)胞核內(nèi)，如出現(xiàn)在成纖維細(xì)胞或其他細(xì)胞內(nèi)，則表示組織細(xì)胞增殖活躍。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在治療后72h三種負(fù)壓治療模式中創(chuàng)面組織中皮膚毛囊上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞PCNA均呈現(xiàn)高表達(dá)，均與對(duì)照組創(chuàng)緣周圍正常皮膚有顯著差異。治療48h間斷負(fù)壓及變壓負(fù)壓治療組創(chuàng)面組織中皮膚毛囊上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞PCNA均呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，與對(duì)照組創(chuàng)緣周圍正常皮膚有顯著差異，而持續(xù)負(fù)壓吸引組則為弱陽(yáng)性表達(dá)。在治療開(kāi)始的24h三組創(chuàng)面PCNA均呈陰性。這一結(jié)果也與創(chuàng)面細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符。

封閉式負(fù)壓吸引治療可改善創(chuàng)面的血液微循環(huán)并促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)。相對(duì)傳統(tǒng)的持續(xù)負(fù)壓，間斷負(fù)壓及變壓負(fù)壓這兩種負(fù)壓吸引模式，能夠較早的誘導(dǎo)創(chuàng)面細(xì)胞增殖，促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)及傷口收縮。因此，在封閉式負(fù)壓吸引技術(shù)治療慢性創(chuàng)面時(shí)，間斷負(fù)壓和變壓負(fù)壓這兩種模式可以作為治療中的優(yōu)先選擇。

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