臨床病理檢驗(yàn)中不同骨組織脫鈣液效果的比較

李玉蓮，徐曉艷(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，呼和浩特 00059;內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科;通訊作者，E-mail:xxy_patho@63.com)

含有骨質(zhì)的腫瘤，鈣化組織及骨髓穿刺組織都很堅(jiān)硬，要想制成幾微米的漂亮HE切片是很困難的。脫鈣液是決定骨骼、牙齒、病理性鈣化或骨化組織切片質(zhì)量、染色效果的關(guān)鍵技術(shù)之一。目前使用的脫鈣液大多數(shù)是無機(jī)強(qiáng)酸類制劑，雖然脫鈣效果好，但造成組織形態(tài)，特別是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇了傳統(tǒng)的脫鈣液和快速脫鈣液兩種脫鈣液進(jìn)行比較，進(jìn)而尋找一種更適合于骨組織脫鈣的方法。研究中發(fā)現(xiàn)快速脫鈣液在不破壞組織結(jié)構(gòu)及影響染色的同時(shí)，它可促進(jìn)脫鈣并加快脫鈣速度，防止纖維性組織過度膨脹，并且保證了切片的質(zhì)量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2009-2011年手術(shù)切除的骨腫瘤、病變骨及骨髓穿刺病人標(biāo)本共40例。根據(jù)標(biāo)本的不同將骨組織取成體積為1.5 cm×1.5 cm×0.5 cm的薄片(骨髓一般直徑均為0.1 cm)，放入10%中性福爾馬林固定24 h，用于脫鈣實(shí)驗(yàn)。

1.2 普通脫鈣液及脫鈣方法與步驟

普通脫鈣液是5%的硝酸，即5 ml硝酸加入95 ml蒸餾水配制而成。具體脫鈣步驟:①先把大塊骨組織標(biāo)本切成小段，小塊骨組織標(biāo)本不用改刀，然后放入10%中性福爾馬林中固定24 h左右后再進(jìn)行脫鈣。②將待脫鈣的標(biāo)本放入5%硝酸脫鈣液中，脫鈣液不少于待脫鈣標(biāo)本總體積的10倍。③室溫下進(jìn)行脫鈣:骨髓穿刺標(biāo)本需30-60 min，肋骨、指趾骨需3-6 d，皮質(zhì)骨需要5-7 d。④脫鈣后的組織經(jīng)流水沖洗后進(jìn)行取材、脫水、透明、常規(guī)石蠟包埋、制片。

1.3 快速脫鈣液及脫鈣方法與步驟

快速脫鈣液是由36%-38%鹽酸8 ml、冰醋酸5 ml、水楊酸10 g、蒸餾水87 ml混合而成。用微波爐進(jìn)行微波時(shí)，微波輻射可加速組織內(nèi)部分子運(yùn)動(dòng)，加快脫鈣速度，因標(biāo)本在酸性溶液中滯留的時(shí)間短，所以對(duì)組織的損傷小。具體脫鈣步驟:①先把大塊骨組織標(biāo)本切成小段，小塊骨組織標(biāo)本不用改刀，然后放入裝有快速脫鈣液的耐高溫塑料容器或玻璃容器內(nèi)，容器要大并加蓋，脫鈣液不少于待脫鈣標(biāo)本總體積的10倍。②再將容器放入最大功率為850 W的醫(yī)用微波爐中進(jìn)行微波脫鈣。③入微波內(nèi)加熱高檔(850 W)5 min達(dá)100℃，骨髓穿刺標(biāo)本繼續(xù)留置10 min，其他標(biāo)本繼續(xù)留置30 min為一個(gè)循環(huán)，檢查脫鈣效果。④脫鈣后的標(biāo)本無需水洗，直接進(jìn)行病理取材、脫水、透明，常規(guī)石蠟包埋、制片。

1.4 脫鈣時(shí)間

室溫下普通脫鈣液及微波條件下快速脫鈣液進(jìn)行各種組織脫鈣所需時(shí)間有所不同，具體見表1。

表1 兩種脫鈣液具體脫鈣時(shí)間比較Table 1 Comparison of specific decalcification time between two kinds of decalcification solutions

2 結(jié)果

標(biāo)本用快速脫鈣液處理后的效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于普通硝酸脫鈣，經(jīng)此脫鈣液防止了纖維性組織過度膨脹，減少對(duì)骨組織結(jié)構(gòu)完整性的破壞，制成的組織切片厚度一般為4-5 μm，不易脫片，并且切片平坦完整，薄厚均勻，HE染色新鮮，尤其細(xì)胞核染色清晰，著色鮮艷(圖1A、1B，見第1004頁)。而普通脫鈣液制成的組織切片，薄厚不均，切片不完整，HE染色模糊，尤其是核著色不清，影響病理診斷(圖1C、1D，見第1004頁)。

圖1 兩種脫鈣液對(duì)骨組織脫鈣后進(jìn)行常規(guī)石蠟制片的效果觀察Figure 1 HE staining of bone tissue after bone decalcification by two kinds of decalcification solutions

3 討論

因骨組織、骨腫瘤含有大量的鈣鹽，鈣鹽只有遇酸溶解后組織變軟才能制作切片［1］。脫鈣是應(yīng)用化學(xué)或物理的方法將骨組織成分中的鈣鹽及膠原纖維分離，棄去鈣鹽保留完整的膠原纖維成分［2］。

無論是任何一種脫鈣方法都是為了清除骨組織鈣鹽而使骨組織變軟進(jìn)而進(jìn)行制片［3］。但是不同脫鈣方法對(duì)骨組織制片影響不同，因此選擇優(yōu)質(zhì)、方便、快捷的脫鈣方法對(duì)骨組織方面疾病的病理診斷至關(guān)重要［4］。

傳統(tǒng)脫鈣方法是將標(biāo)本取好直接放入5%硝酸溶液中進(jìn)行脫鈣，一般需要1-10 d，然后再經(jīng)固定脫水、包埋切片;切片厚度約在6-7 μm以上，并且切片時(shí)組織不完整，厚薄不均又易脫片，不僅損刀片，脫鈣時(shí)間也不好掌握［2］。因?yàn)樗嵩谌芙忖}鹽的同時(shí)也溶解膠原纖維，雖然部分被溶解的鈣鹽與膠原纖維分離，但是還有部分鈣鹽與溶解的膠原混合存在，這樣妨礙了鈣鹽與膠原纖維的徹底分離，阻滯了酸由表及里地溶解鈣鹽的作用。結(jié)果 造成脫鈣時(shí)間延長(zhǎng)、脫鈣不徹底或脫鈣后的組織不完整、進(jìn)而破壞組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)果及細(xì)胞成分的性質(zhì)。最終造成細(xì)胞核不著色或著色很淺，從而影響對(duì)病變組織的病理診斷［5］。

而采用快速脫鈣液進(jìn)行脫鈣一般需要10-40 min，不但將脫鈣時(shí)間縮短，同時(shí)保證了制片質(zhì)量［4］。因?yàn)榭焖倜撯}液中的水楊酸具有松懈作用，能加速酸性溶液由表及里地溶解鈣鹽，被溶解的鈣鹽迅速發(fā)生沉淀，減少了與溶解膠原的混合，充分發(fā)揮水楊酸松解膠原作用;促進(jìn)脂肪溶解，并且水楊酸還能破壞蛋白質(zhì)的交聯(lián)，疏通組織間隙，有利于鈣鹽析出快速脫鈣［6］。因組織在酸性溶液里滯留時(shí)間短，對(duì)組織損害小，這樣切片較完整，染色效果極佳［7］。此種脫鈣方法簡(jiǎn)單、便捷、快速，是有效的骨組織脫鈣方法，有利于保存骨組織結(jié)構(gòu)和組織中的抗原物質(zhì)，從而確保了臨床病理診斷［7］。

總之，我們認(rèn)為快速脫鈣液要比普通脫鈣液在臨床診斷上更為適用。此種脫鈣液在不破壞組織結(jié)構(gòu)及影響染色的同時(shí)，可促進(jìn)脫鈣并加快脫鈣速度，防止纖維性組織過度膨脹，并且保證了良好的切片質(zhì)量［6，8］。

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