乳白蟻屬Coptotermes 分子分類研究進(jìn)展

丁俊杰，喻 敏，劉志文，權(quán)永兵，龐正平，平正明，王建國*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南昌 330045;2.江蘇常州市武進(jìn)區(qū)白蟻防治所，江蘇常州 213159;3.廣東省昆蟲研究所，廣州 510260;4.江蘇無錫江陰市白蟻防治所，無錫 214400)

乳白蟻屬Coptotermes 隸屬等翅目Isoptera 鼻白蟻科Rhinotermitidae，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，其生活隱蔽，繁殖迅速，破壞力極強(qiáng)，危害范圍十分廣泛，在世界上引起許多國家的廣泛關(guān)注(李桂祥，1988;平正明，1996;黃復(fù)生，2000)。Rust ＆ Su(2012)描述了世界乳白蟻主要危害種的分布及防治策略。乳白蟻不僅危害農(nóng)林作物，蛀食多種堅硬的木材，甚至為害含纖維素的木材加工品如紙、棉布、皮革制品等，還能危害地下通訊電纜等的塑料保護(hù)層，更重要的是它在傳入或輸出后能在新的地域快速建群、繁殖、擴(kuò)散，給新的地域造成損失和危害。目前，在世界主要白蟻分布區(qū)中，中國共有乳白蟻22種(黃復(fù)生，2000;Li，2011)，印度-馬來西亞19種，澳洲10種，泰國5種，馬來西亞5種，印度尼西亞和西伊朗3種，巴布亞新幾內(nèi)亞等太平洋島嶼8種，非洲6種(馬達(dá)加斯加1種)，中、南美洲3種(Kambhampati and Eggleton，2000)。

1 乳白蟻屬傳統(tǒng)分類鑒定的難度及存在的問題

乳白蟻種類的形態(tài)鑒定比較困難，這與白蟻?zhàn)陨淼男螒B(tài)結(jié)構(gòu)和特性是密切相關(guān)的。白蟻是典型的多形態(tài)社會性巢居昆蟲，蟻巢結(jié)構(gòu)精密，在同一個群體中同時存在不同品級和多種蟲態(tài)，促使白蟻的形態(tài)有著各種各樣復(fù)雜的變化。同一個種、同一個巢群，不同個體由于分工不同，其形態(tài)特征截然不同(李桂祥，2002);其次，白蟻壽命長，個體從低齡到高齡，體形大小上有明顯差異，直至蟻巢成熟才趨于穩(wěn)定;再次，由于白蟻多在地下或被害物內(nèi)等隱蔽場所活動，一生中大部分時間在黑暗的隱蔽環(huán)境中活動，產(chǎn)生了強(qiáng)烈的趨同現(xiàn)象，造成白蟻的外部形態(tài)特征相似，體壁柔軟，骨化程度低，能夠用于分類鑒定的性狀非常少。此外白蟻的生殖隔離機(jī)制主要不是通過生殖器官的結(jié)構(gòu)來完成的，白蟻有翅繁殖蟻生殖器，無論雌、雄均為幾塊簡單的骨片，分類鑒定時無法采用生殖器的特征。目前白蟻主要形態(tài)特征分類依據(jù)是兵蟻和有翅成蟲個體的度量數(shù)據(jù)，這需要對大量個體的測量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，而且嚴(yán)重易受人為因素的干擾。同時，受環(huán)境和地理?xiàng)l件的影響也相當(dāng)大，不同地理種群的白蟻在形態(tài)數(shù)據(jù)的測量上也不盡一致，難以可靠地分析和鑒別近似種間存在的差異，導(dǎo)致實(shí)際鑒定過程中可靠性低，準(zhǔn)確性差。因此白蟻種類識別困難，人為分類現(xiàn)象嚴(yán)重，同物異名現(xiàn)象普遍(Kambhampati and Eggleton，2000)，這一定程度上阻礙了白蟻分類學(xué)的發(fā)展。世界著名的白蟻分類學(xué)家Holmgren(1913)就認(rèn)為，乳白蟻屬下各種，彼此特征極相類似，鑒定工作非常困難。

2 分子分類的優(yōu)勢

傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)的局限性導(dǎo)致乳白蟻分類混亂的現(xiàn)象長久以來都沒有徹底解決，而基于分子生物技術(shù)對乳白蟻進(jìn)行分類鑒定的研究取得了很好的進(jìn)展。

傳統(tǒng)的形態(tài)分類累積了很多如同物異名、鑒定錯誤等問題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，從分子生物領(lǐng)域?qū)o法界定和界定模糊的乳白蟻種類重新鑒定和分類，對白蟻分類學(xué)具有非常重要的推動作用。由于各蟲態(tài)子代白蟻的基因來自相同母體，故基因的變異概率很低，同一巢群的任何品級和各種蟲態(tài)所獲得的DNA 序列均可代表該群體的遺傳信息。因此利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行白蟻鑒定，對白蟻蟲態(tài)、品級沒有太多要求。分子生物學(xué)技術(shù)對樣品數(shù)量要求也非常少，單頭白蟻只需部分腹部體壁即可提取到足夠的DNA 模板，達(dá)到了非損傷性取樣目的，而剩余的白蟻標(biāo)本并不會影響形態(tài)特征的核定。

應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行白蟻分類也使得鑒別種類容易、準(zhǔn)確和快速;鑒定白蟻種類分子標(biāo)記的使用增加了樣品中鑒定的敏感性，加快了鑒定的速度;生物技術(shù)直接檢測白蟻的基因組，排除了環(huán)境變化的影響，從而達(dá)到了快速準(zhǔn)確地鑒定白蟻種類的目的。需要強(qiáng)調(diào)的是，現(xiàn)代分子技術(shù)雖然為白蟻的快速準(zhǔn)確鑒定提供了可能，但在進(jìn)行白蟻鑒定研究時仍然需要以傳統(tǒng)的形態(tài)分類作為研究的基礎(chǔ)，兩種方法相互印證才能達(dá)到較好效果。

3 乳白蟻屬分子分類進(jìn)展

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展對乳白蟻屬Coptotermes系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定研究提供了新的思路并且取得良好進(jìn)展。DNA 測序、微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)等PCR 及其相關(guān)技術(shù)已應(yīng)用到白蟻的近似種鑒定上(王建國，2004;Hussendeder et al.，2005;楊嘉理，2010;丁俊杰，2013)。這些分子生物技術(shù)在白蟻分類鑒定方面取得探索性的研究成果。

3.1 微衛(wèi)星標(biāo)記

Thompson 等(2000)利用微衛(wèi)星技術(shù)對C.lacteus 進(jìn)行了研究。Vargo 等(2000)對臺灣乳白蟻17個地理種群進(jìn)行微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)鑒定，找到15個微衛(wèi)星標(biāo)記，為調(diào)查本地種和入侵種的遺傳結(jié)構(gòu)提供了敏感的工具。利用微衛(wèi)星標(biāo)記研究了入侵日本九州，福江兩島的臺灣乳白蟻種群遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果和最近的遺傳瓶頸并無明顯差異，說明兩地白蟻入侵已有超過300年的歷史(Vargo et al.，2003)。Yeap 等(2009)開發(fā)了11個微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物，并用于對亞洲格斯特乳白蟻28個種群的鑒定分析，為種群內(nèi)和種群間遺傳結(jié)構(gòu)分析提供了有利幫助。利用微衛(wèi)星標(biāo)記對采自美國，臺灣地區(qū)，東南亞5 國的85個格斯特乳白蟻種群進(jìn)行遺傳多樣性研究。結(jié)果表明85個種群分為四個大支，臺灣地區(qū)格斯特乳白蟻由菲律賓引入(Yeap et al.，2011)。

3.2 序列系統(tǒng)發(fā)育分析方法

乳白蟻?zhàn)鳛閷θ祟惿瞽h(huán)境和自然環(huán)境危害最嚴(yán)重的一類白蟻，其起源分析和全球范圍的傳播擴(kuò)散路徑分析，對乳白蟻的預(yù)防控制具有重要的意義。而基于分子生物信息的乳白蟻系統(tǒng)發(fā)育分析和分類研究的基礎(chǔ)工作尤為重要，歷來受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。

3.2.1 線粒體基因

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)具有相對分子質(zhì)量小，嚴(yán)格母性遺傳，世代間不發(fā)生重組，易于提純和遺傳標(biāo)記豐富等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動物起源、分類、系統(tǒng)進(jìn)化、群體遺傳結(jié)構(gòu)和育種等方面的研究(Simon，1994)。其包含的基因諸如細(xì)胞色素氧化酶亞基I，Ⅱ(COI，COⅡ)，16S 核糖體RNA(16S rRNA)基因，12S核糖體RNA(12S rRNA)基因等被許多專家應(yīng)用于乳白蟻分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析。

Jenkins 等(2002)利用COⅡ基因序列推斷臺灣乳白蟻入侵危害的來源。揭示了臺灣乳白蟻14個地理種群的8個特殊支系，其中中國廣東新會種群和夏威夷種群接近。Austin 等(2006)利用COⅡ基因，結(jié)合地理系統(tǒng)學(xué)對臺灣乳白蟻從中國、日本等東南亞地區(qū)傳入夏威夷和美國本土的路徑，進(jìn)行了詳細(xì)的研究，研究首次證實(shí)了臺灣乳白蟻傳入美國本土的路徑有兩條。Lo 等(2006)根據(jù)線粒體COⅡ基因?qū)Π拇罄麃喌娜榘紫亴俜N類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)澳洲乳白蟻 C.lacteus Froggatt、大唇乳 蟻 C.frenchi Hill 和 C.michaelseni Silvestri 各自形成緊密關(guān)系的單系群，而短刀乳白蟻C.acinaciformis Froggatt 則沒有，該種C.acinaciformis 可能是復(fù)合種。某些澳大利亞的種類和某些亞洲種類的關(guān)系更緊密。Gentz 等(2008)利用COⅡ基因標(biāo)記對美國本土及夏威夷的臺灣乳白蟻種群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明均源自亞洲。Long 等(2009)利用微衛(wèi)星標(biāo)記和COⅡ基因，對包括臺灣乳白蟻在內(nèi)的中國東部5種白蟻進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，所有樣本形成兩個分支。Zhu 等(2010)對密西西比州南部地區(qū)臺灣乳白蟻COⅡ基因片段的堿基組成和含量進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示臺灣乳白蟻至少兩次傳入美國。Martins 等(2010)基于COⅡ基因?qū)Π臀鞲袼固厝榘紫伒钠鹪催M(jìn)行推論，并且報道了三個新的分布地，擴(kuò)展了格斯特乳白蟻的分布。王新國等(2012)基于不同兵蟻形態(tài)和COI 基因?qū)ε_灣乳白蟻進(jìn)行比較研究，COI 數(shù)據(jù)佐證了形態(tài)學(xué)研究結(jié)果。Scheffrahn 等(2004)利用16S rRNA 標(biāo)記證明來自西非的乳白蟻Coptotermes sjostedti 通過海上運(yùn)輸貿(mào)易入侵到法屬瓜德羅普島。Li 等(2009)利用COⅡ，12S rRNA 和16S rRNA 研究了臺灣地區(qū)格斯特乳白蟻和臺灣乳白蟻的譜系地理學(xué)，結(jié)果表明臺灣有可能是臺灣乳白蟻的起源中心，格斯特乳白蟻是外來引進(jìn)的。張衛(wèi)東等(2010)針對6種乳白蟻16S rRNA 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示塞龐乳白蟻C.sepangensis 與曲顎乳白蟻C.curvignathus 關(guān)系最近，臺灣乳白蟻C.formosanus與廣州乳白蟻C.guangzhouensis 遺傳距離為0.000，存在同物異名的可能。同時明確了乳白蟻不同種之間的親緣關(guān)系和變異程度，以及在系統(tǒng)進(jìn)化中的地位。

王建國(2004)利用COⅡ基因和16S rRNA基因分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析中國廣東8個臺灣乳白蟻種群和美國夏威夷、泰國的臺灣乳白蟻，結(jié)果顯示序列完全一致，另外三個美國種群(新奧爾良、佐治亞州和德克薩斯州)單獨(dú)構(gòu)成一枝，但與其他種群的遺傳距離很小，說明美國三地的臺灣乳白蟻種群在當(dāng)?shù)亟ㄈ汉?，適應(yīng)生態(tài)環(huán)境，在遺傳上發(fā)生了一定的變異。又利用這兩個基因?qū)碜园筒紒喰聨變?nèi)亞的端明乳白蟻C.elisae 和馬來西亞的曲顎乳白蟻C.curvignathus 進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)他們聚合形成一個單系群，4個進(jìn)化枝間的遺傳距離非常接近，支持端明乳白蟻與曲顎乳白蟻為同一物種。Yeap 等(2007)對來自東南亞地區(qū)的9個格斯特乳白蟻C.gestroi種群和4個菲島乳白蟻C.vastator種群的COⅡ、12S rDNA 和16S rDNA 基因序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的C.gestroi 和C.vastator種群的基因沒有任何差別，確定后者為前者的一個同物異名。Ghesini 等(2011)利用COⅡ和16S rDNA 基因鑒定并首次報道了在意大利發(fā)現(xiàn)格斯特乳白蟻。Hausberger 等(2011)結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類，利用COI，COⅡ，28S rDNA 標(biāo)記基因?qū)ξ鞣谴蟛菰紫伓鄻有赃M(jìn)行鑒定研究(包括乳白蟻屬)。他指出傳統(tǒng)分類方法并不可靠，亟需可靠的現(xiàn)代生物技術(shù)解決。

3.2.2 核內(nèi)標(biāo)記ITS

編碼核糖體RNA 的基因(rDNA-ITS)是真核生物中最為保守的結(jié)構(gòu)基因。ITS 標(biāo)記在種內(nèi)的穩(wěn)定性及種間的差異，使得該標(biāo)記成為近年來用于乳白蟻遺傳變異、系統(tǒng)進(jìn)化及分子鑒定研究的一個熱點(diǎn)。

王建國(2004)基于ITS1 序列對中國臺灣乳白蟻五個地理種群進(jìn)行比較，結(jié)果序列完全相同，暗示ITS1 序列可用于白蟻種類的分子鑒定。張衛(wèi)東等(2012)證實(shí)，大家白蟻、臺灣乳白蟻和黃胸散白蟻不同品級間的ITS 序列并無差異，排除了標(biāo)記基因本身在不同種群和蟲態(tài)之間存在差異而導(dǎo)致對遺傳分析準(zhǔn)確性的干擾。利用口岸截獲的5種乳白蟻核基因ITS 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示曲顎乳白蟻C.curvignathus 和塞龐乳白蟻C.sepangensis 關(guān)系最近，婆羅乳白蟻C.borneemsis 與其他種進(jìn)化距離最遠(yuǎn)。權(quán)永兵(2012)擴(kuò)增得到7種乳白蟻ITS 序列，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹明確其親緣關(guān)系，并指出ITS 區(qū)基因可成為乳白蟻屬內(nèi)種類分類鑒定的理想目標(biāo)基因，但不適用于不同地理種群間的系統(tǒng)進(jìn)化分析。

3.2.3 線粒體基因與核內(nèi)標(biāo)記聯(lián)合使用

Jenkins 等(2007)通過16S rRNA，COⅡ和ITS 標(biāo)記明確了波多黎各、美國俄亥俄州、佛羅里達(dá)和澳大利亞的布里斯班新發(fā)現(xiàn)的C.gestroi 的來源，新加坡和馬來西亞極有可能分別是俄亥俄州和澳大利亞的格斯特白蟻種群的發(fā)源地。丁俊杰(2013)基于COI，COⅡ，16S rRNA 和ITS 四種標(biāo)記對中國10種乳白蟻進(jìn)行研究，結(jié)果顯示10種乳白蟻?zhàn)罱K應(yīng)合并為兩種，即臺灣乳白蟻和格斯特乳白蟻，并推測中國乳白蟻屬僅有兩個復(fù)合種，并無亞屬之分。

4 乳白蟻屬現(xiàn)有核苷酸序列信息

美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI(National Center for Biotechnology Information)，旨在建立關(guān)于分子生物學(xué)、生物化學(xué)、和遺傳學(xué)知識存儲和分析的自動系統(tǒng)。全球?qū)W者皆可將所得生物分子信息上傳共享，因而其收錄了世界上最全的生物分子信息，包括乳白蟻屬最全的基因序列信息。截止2014年4月2 日，網(wǎng)站共收錄34個上傳的乳白蟻屬分類單位，24個為定名種類，10個為未定名種。用于乳白蟻分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析的核苷酸序列837 條(如表1 所示)，這其中序列數(shù)量最多的種類依次是臺灣乳白蟻C.formosanus 384條，格斯特乳白蟻C.gestroi 181 條，短刀乳白蟻C.acinaciformis 49 條，印巴乳白蟻C.heimi 45 條，澳洲乳白蟻C.lacteus 43 條，曲顎乳白蟻C.curvignathus 19 條。所有標(biāo)記基因中又以CO Ⅱ，16S rRNA，COI 和12S rRNA 基因標(biāo)記的數(shù)量最多(如圖1 所示)。

表1 乳白蟻屬Coptotermes 現(xiàn)有序列信息表Table 1 Sequences of the genus Coptotermes in NCBI before Feb.26，2014

(續(xù)上表)

圖1 乳白蟻分子分類和系統(tǒng)發(fā)育分析所用主要遺傳標(biāo)記Fig.1 Genetic markers used in Coptotermes classification and systematic analysis

5 展望

5.1 DNA 條形碼技術(shù)在乳白蟻屬分類中的應(yīng)用

利用分子生物學(xué)技術(shù)對昆蟲進(jìn)行分類鑒定是形態(tài)分類的重要補(bǔ)充手段，可彌補(bǔ)形態(tài)鑒定之不足，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確鑒定。Hebert 等(2003a)提出用線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(COI)基因作為DNA 條形碼運(yùn)用于生物分類研究。此后以COI基因作為DNA 條形碼的應(yīng)用研究已逐步深入。DNA 條形碼技術(shù)在鱗翅目(Hajibabaei et al.，2006;Burns et al.，2007;2008)、鞘翅目(Monaghan et al.，2005)、蜉蝣目(Ball et al.，2005;Alexander et al.，2009)、半翅目(Ball and Armstrong，2007)、雙翅目(范京安等，2009)等昆蟲鑒定中得到了很好的應(yīng)用，而且該技術(shù)在種間親緣關(guān)系，隱存種發(fā)現(xiàn)等研究中有很大的作用，得到了許多學(xué)者的肯定和支持(Hebert，2003b;Schindel and Miller，2005;Aravind et al.，2007;Hollongsworth，2007)，但也有一些學(xué)者持反對意見(Lipscomb，2003;Seberg，2003;Will and Rubinof，2004;Ebach and Holdrege，2005;Malte and Craig，2005;Marshall，2005)。DNA 條形碼技術(shù)是否適用于乳白蟻屬種類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析未見報道。NCBI 中目前收錄乳白蟻COI 序列數(shù)量為112 條，數(shù)量及種類都比較少，還需要充實(shí)COI數(shù)據(jù)量。

Mallet 和Willmott(2003)建議最好應(yīng)用多個基因片段區(qū)分形態(tài)相似的物種，而不是單一的基因，而且有研究認(rèn)為，COI 基因不適合有些類群的鑒定(Hebert，2003;Vences，2005)。由此可見，針對不同的生物類群，選擇不同的基因片段或者增加多個片段也是十分必要的。要找到?jīng)Q定不同白蟻種間差異的目標(biāo)基因，進(jìn)行白蟻各種間分化的分子機(jī)制研究，具有很大的挑戰(zhàn)性。目前NCBI中收錄的乳白蟻分子信息仍然較少，分子信息集中于某個種或某個基因，亟需擴(kuò)充其他種類的分子信息數(shù)據(jù)。

5.2 線粒體全基因組用于乳白蟻分類

線粒體全基因組包含基因多，信息量大，可使白蟻種類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析更準(zhǔn)確。Tokuda等(2011)上傳了臺灣乳白蟻C.formosanus 線粒體全基因序列并建議進(jìn)行線粒體全基因組測序用于乳白蟻種類鑒定。Cameron 等(2012)獲得澳洲乳白蟻C.lacteus 線粒體全基因序列。這為乳白蟻屬基于分子信息學(xué)對近似種進(jìn)行修訂以及發(fā)掘隱含種提供了堅實(shí)基礎(chǔ)。

本團(tuán)隊基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法，通過研究中國乳白蟻種類的線粒體細(xì)胞色素氧化酶I(COI)基因、線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅱ(CO Ⅱ)基因、16S rRNA 基因以及核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)等標(biāo)記，分別進(jìn)行同源性分析，分子系統(tǒng)學(xué)分析，以期對中國乳白蟻屬疑似的同物異名種進(jìn)行重新厘定，明確其分類地位，為中國乳白蟻屬在分子水平上的分類和近緣種的鑒別提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。目前獲得乳白蟻COI 基因序列8種37 條(GeneBank 登錄號 KC887191-KC887227)，COⅡ基因序列10種47 條(GeneBank 登錄號為KC515403-KC515449)，16S rRNA 基因序列9種46 條(GeneBank 登錄號為KC887100-KC887145)和ITS 基因序列10種45 條(GeneBank 登錄號為KC887146-KC887190)。初步結(jié)果顯示我國乳白蟻屬可能僅有2個乳白蟻復(fù)合種，即臺灣乳白蟻，格斯特乳白蟻。

研究結(jié)果可應(yīng)用于乳白蟻的鑒定，對有效抵御外來有害生物的入侵，保護(hù)我國農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)安全，維持生態(tài)平衡，保證公共衛(wèi)生安全都有極為重要的意義。研究成果將對我國乳白蟻屬的分類鑒定作出一定的貢獻(xiàn)，產(chǎn)生積極的社會價值和經(jīng)濟(jì)價值。分子生物技術(shù)的快速發(fā)展將促使白蟻分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析等多項(xiàng)領(lǐng)域更廣泛深入的發(fā)展。

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