CO2氣腹環(huán)境對人宮頸癌Hela細(xì)胞生長及卡鉑敏感性的影響

艾 君 韓 萍李 楠

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 河北唐山 063000)

隨著微創(chuàng)手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，腹腔鏡在婦科良性腫瘤手術(shù)中的應(yīng)用日益增多。但腹腔鏡用于惡性腫瘤手術(shù)的安全性，特別是術(shù)后發(fā)生腫瘤腹腔擴(kuò)散和穿刺點(diǎn)轉(zhuǎn)移的問題引起很大的爭議［1］，主要焦點(diǎn)是CO2氣腹是否促進(jìn)腫瘤生長與種植轉(zhuǎn)移以及腹腔鏡術(shù)后化療藥物敏感性問題。Hela細(xì)胞是宮頸癌中典型的癌細(xì)胞，增殖異常迅速，常被用作實(shí)驗(yàn)室研究的對象。本實(shí)驗(yàn)選取人宮頸癌Hela細(xì)胞為研究對象，采用CCK8法檢測細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞儀PI染色分析細(xì)胞周期;Annexin V-FITC檢測細(xì)胞早期凋亡率，探討體外模擬腹腔鏡CO2氣腹環(huán)境對人宮頸癌Hela細(xì)胞生長，及經(jīng)過CO2環(huán)境作用后人宮頸癌Hela細(xì)胞對化療藥物卡鉑敏感性的影響，以評價(jià)CO2氣腹腹腔鏡手術(shù)在宮頸惡性腫瘤手術(shù)中應(yīng)用的安全性，并為腹腔鏡術(shù)后早期使用化療藥物的可靠性、必要性和有效性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑和儀器DMED培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，卡鉑(大連美侖生物技術(shù)公司)，青霉素為華北制藥集團(tuán)公司產(chǎn)品;鏈霉素為山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品;乙醇(上海國藥集團(tuán))，Annexin V/PI檢測試劑盒(BD公司)，CCK-8試劑盒(碧云天公司)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，CO2氣腹機(jī)(日本OLYMPUS公司)流式細(xì)胞儀(FACSCalibur BD公司)，細(xì)胞過濾器(Millipore公司)，酶標(biāo)儀MK3(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)。人宮頸癌Hela細(xì)胞株購自上海中科院，細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均系傳2～3代后的對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理。共分為4組，①對照組:細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)72h;②CO2組:細(xì)胞置于3L無菌引流袋內(nèi)，密閉后用無菌引流管與腹腔鏡氣腹機(jī)連接，將氣腹機(jī)壓力調(diào)至12mmHg通入99.5%醫(yī)用 CO2，流速2.5L/min，將無菌引流袋連同其內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)基一起放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，持續(xù)作用2h后，從引流袋內(nèi)取出培養(yǎng)瓶，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)72h;③卡鉑組:細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后換用含20μg/mL卡鉑培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h;④CO2+卡鉑組:細(xì)胞在經(jīng)過上述CO2處理后常規(guī)培養(yǎng)24h，再換用含20μg/mL卡鉑的培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.2.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測。采用Cell Cownting Kit-8(CCK-8)法。取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，以1×106/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL。每組設(shè)3個平行復(fù)孔。按上述要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理后，每孔加入10μLCCK-8液37℃細(xì)胞孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，采用全自動酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長測定各孔吸光度值，分別計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的增殖抑制率。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞技術(shù)(PI染色法)檢測細(xì)胞周期。取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞以1×106/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板中。按上述細(xì)胞處理方法完成細(xì)胞處理;0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，PBS液洗2次，1000r/min離心5min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，遇冷70%的冰乙醇固定細(xì)胞，并吹打成單細(xì)胞懸液，4℃過夜。2000r/min離心10min，用 PBS洗滌細(xì)胞2次，加入10μL RnaseA(1mg/mL)，加入 50μL PI染液(50μg/mL)，4℃避光30min，用300目尼龍網(wǎng)過濾樣品后上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.2.5 流式細(xì)胞技術(shù)(Annexin V-FITC分析)檢測細(xì)胞早期凋亡率。按上述同法收集各組Hela細(xì)胞，每組計(jì)數(shù)1×106/mL，離心，棄上清，用冷PBS洗2次，按照流式試劑盒的說明染色，隨即用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測，用波長為530nm的通帶濾器檢測FITC熒光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用()表示，組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 人宮頸癌Hela細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞增殖抑制情況本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:CO2處理組的人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖抑制率明顯降低，卡鉑組與CO2+卡鉑組比較細(xì)胞的增殖抑制率無明顯差異。CO2組與CO2+卡鉑組比較，腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率明顯增加，具體見圖1。

圖1 人宮頸癌Hela細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞增殖情況

2.2 人宮頸癌Hela細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞周期變化 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CO2處理組與對照組比較細(xì)胞周期無明顯改變;卡鉑組與CO2+卡鉑組比較，細(xì)胞周期改變無明顯差異;與對照組相比，卡鉑處理組細(xì)胞周期有規(guī)律性改變，見表1。卡鉑處理組可見G1、G2期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞顯著增多，見表1。

表1 人宮頸癌Hela細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞周期分布

2.3 人宮頸癌Hela細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞凋亡情況 本實(shí)驗(yàn)CO2組與對照組比較細(xì)胞凋亡率明顯下降，卡鉑組與CO2+卡鉑組比較細(xì)胞凋亡率未見明顯增加，CO2組與CO2+卡鉑組比較，后者細(xì)胞凋亡率明顯增加。具體見表2。

表2 人宮頸癌Hela細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞凋亡率(±s)

表2 人宮頸癌Hela細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞凋亡率(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;CO2組與CO2+卡鉑組比較，#P＜0.05

組別 早期凋亡率(%)CO2組 1.13±0.07*1.51±0.11卡鉑組 2.47±0.67*CO2+卡鉑組 2.40±0.67*#對照組

3 討論

隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，腹腔鏡手術(shù)臨床應(yīng)用日益廣泛，惡性腫瘤行腹腔鏡手術(shù)在技術(shù)上是可行的，有報(bào)道認(rèn)為腹腔鏡術(shù)后穿刺孔腫瘤轉(zhuǎn)移明顯高于開腹手術(shù)，可能與過去腹腔鏡技術(shù)不完善有關(guān)，隨著腹腔鏡技術(shù)的提高，最近報(bào)道腹腔鏡術(shù)后穿刺孔腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生率低于1%，與開腹手術(shù)無明顯差異［2］。隨著手術(shù)條件的成熟和設(shè)備的更新，技術(shù)上的難題已得到解決，現(xiàn)在爭議的焦點(diǎn)集中在腹腔鏡CO2氣腹環(huán)境是否會促進(jìn)癌細(xì)胞的播散及種植轉(zhuǎn)移［3］。國內(nèi)外大量研究證實(shí)CO2氣腹能促進(jìn)術(shù)后PSM和腫瘤增殖［4，5］，嚴(yán)重影響患者術(shù)后生活質(zhì)量和5年存活率。也有學(xué)者持相反觀點(diǎn):Leng J.等［6］將人卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3和HO8910)在模擬CO2氣腹環(huán)境下進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別給予不同的壓力及作用時間，發(fā)現(xiàn)HO8910細(xì)胞生長速度與CO2壓力和作用時間呈反比，而SKOV3細(xì)胞株的生長也有著類似變化，并以細(xì)胞的G1期最為明顯。CO2能否促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長的問題也有待深入研究。

由于手術(shù)或者放療屬局部治療，單純手術(shù)和放療就無法解決腫瘤的擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移，因此，可將化療應(yīng)用于放療和手術(shù)前后，以增加綜合治療效果。當(dāng)前治療宮頸癌的一線藥物中首選鉑類，其敏感性直接關(guān)系到治療效果和5年存活率。鉑類為細(xì)胞周期非特異性抗癌藥，主要是通過選擇性的攻擊增殖細(xì)胞DNA堿基的氮原子，由于鉑類和DNA呈交叉聯(lián)接，對DNA的構(gòu)型有明顯影響，雙螺旋解旋使分子變短;可與DNA形成鏈內(nèi)交聯(lián)，也可形成鏈間交聯(lián)或DNA-蛋白質(zhì)間的交叉聯(lián)結(jié)。本實(shí)驗(yàn)中所使用的卡鉑(CBP)是第二代鉑類藥，與順鉑相比，由于消化道反應(yīng)輕、腎及神經(jīng)毒性小、抗瘤譜廣，目前在臨床使用廣泛。

在腹腔鏡手術(shù)中，使用的氣腹壓力一般是12mmHg，平均氣腹持續(xù)時間為2h左右，因此要研究體外模擬CO2氣腹環(huán)境對人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞生長的影響，首先要建立可靠的體外模擬CO2氣腹環(huán)境模型，并保證體外模擬CO2氣腹環(huán)境的壓力能維持在12mmHg持續(xù)2h。筆者利用無菌的醫(yī)用3L袋和全自動氣腹機(jī)成功建立了體外模擬CO2氣腹環(huán)境，該方法簡單易行，可操控性強(qiáng)，能準(zhǔn)確控制實(shí)驗(yàn)所需的體外模擬CO2氣腹壓力和時間。

本實(shí)驗(yàn)中我們首先采用MTT比色法檢測各組細(xì)胞增殖抑制率;還通過流式細(xì)胞儀將處于各細(xì)胞周期的細(xì)胞分選，我們還通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞早期凋亡率，用以研究體外模擬CO2氣腹環(huán)境對人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖及卡鉑敏感性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:①CO2處理組的人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖抑制率及早期凋亡率均明顯降低，細(xì)胞周期與對照組相比無明顯差異，表明CO2環(huán)境能促進(jìn)人宮頸癌Hela細(xì)胞生長與增殖。其機(jī)制可能為:CO2通過使細(xì)胞外液壓力增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)外壓力差變大，影響細(xì)胞膜的正常生理狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)的;也可能為CO2氣體本身作為一個獨(dú)立因素對細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用;還可能為CO2氣腹通過上調(diào)細(xì)胞抗凋亡基因或者凋亡抑制基因表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖［7～9］。提示在臨床中應(yīng)慎重使用腹腔鏡行宮頸惡性腫瘤手術(shù)。②卡鉑組、CO2+卡鉑組與對照組比較，腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率及早期凋亡率均明顯增加，其機(jī)制可能為卡鉑抑制細(xì)胞周期的有序進(jìn)行密切相關(guān)，卡鉑直接作用于DNA，主要與細(xì)胞DNA的鏈間及鏈內(nèi)交鏈?zhǔn)笵NA受損，DNA受損信號可以通過促分裂原活化蛋白激酶、p53和p73等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)凋亡信號的激活，最終引起細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期抑制［10］;卡鉑組、CO2+卡鉑組與對照組比較，還可見卡鉑處理組G1、G2期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞顯著增多。其機(jī)制可能為:卡鉑使人宮頸癌Hela細(xì)胞阻滯于S期，S期阻滯為細(xì)胞提供充足的時間使受損DNA得到修復(fù)，當(dāng)DNA損傷超過細(xì)胞的修復(fù)或耐受極限時，S期關(guān)卡功能就會減弱，細(xì)胞不能得到有效修復(fù)，最終導(dǎo)致死亡。③CO2組與CO2+卡鉑組比較，細(xì)胞的增殖抑制率有顯著差異;卡鉑組與CO2+卡鉑組比較細(xì)胞的增殖抑制率無顯著差異，表明氣體處理后卡鉑對人宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制率無交互作用，卡鉑抵消了CO2的不利作用。表明模擬腹腔鏡CO2氣腹環(huán)境作用后人宮頸癌Hela細(xì)胞對卡鉑敏感性無明顯改變，提示臨床工作中，可以在腹腔鏡手術(shù)中早期應(yīng)用化療藥物，預(yù)防腹腔鏡術(shù)后腫瘤細(xì)胞腹腔及穿刺口增殖轉(zhuǎn)移，但是藥物劑量尚需進(jìn)行大量的動物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)來確定。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程復(fù)雜，其具體機(jī)制至今未明。本實(shí)驗(yàn)體外模擬CO2氣腹環(huán)境，探討CO2對人宮頸癌Hela細(xì)胞生長的影響及CO2環(huán)境作用后對卡鉑敏感性的變化。但本研究僅僅是在細(xì)胞水平完成的實(shí)驗(yàn)，在體內(nèi)能否可以達(dá)到相似的效果還有待進(jìn)一步進(jìn)行大量的動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究，最終為CO2氣腹腹腔鏡手術(shù)用于宮頸惡性腫瘤手術(shù)的安全性，以及腹腔鏡術(shù)后早期使用卡鉑行輔助化療的有效性、必要性及安全性提供更明確的依據(jù)。

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