白藜蘆醇對小鼠酒精性肝損傷的抑制作用

周曉云 崔曉明 崔國金 蔡慶艷 韓淑英

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000;①內(nèi)蒙古自治區(qū)科左后旗人民醫(yī)院)

醉酒、酗酒會引起身體的不適，大量酒精攝入會造成人體多種器官損害，其中對肝臟的損害尤其嚴(yán)重。隨著人民生活水平的提高，酒精性肝病(Alcohol Liver Disease)已經(jīng)成為繼病毒性肝炎后的另外一種多發(fā)的肝損傷疾?。?］。但目前為止尚沒有一種高效的方法可以減輕酒后反應(yīng)及飲酒帶來的肝損傷。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種廣泛存在于自然界多種植物中的多酚類化合物，具有抗氧化、降低血液粘稠度、預(yù)防癌癥的發(fā)生、抗過敏、抗突變、抗驗(yàn)證、調(diào)節(jié)免疫等藥理活性［2］，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、化妝品和食品添加劑等領(lǐng)域［3］。近年研究表明，Res對過氧化氫、四氯化碳、酒精等所致肝損傷具有抑制作用，且對肝纖維化和肝癌的治療有重要的潛在意義［4～6］。本研究擬通過小鼠酒精性肝損傷模型，研究Res防止酒精性肝損傷的作用機(jī)理，為開發(fā)利用其類似物提供試驗(yàn)資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物。SPF級昆明種雄性小白鼠(北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，許可證號:SCKX(京)2004-0001)，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g。常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，室溫22～25℃，相對濕度40% ～70%。

1.1.2 藥品與試劑。白藜蘆醇(購自中國藥品生物制品檢定所，批號:110742-200517，純度99.9%);超氧化物歧化酶SOD測定試劑(南京建成生物工程研究所，批號:20100503)，丙二醛MDA測定試劑(南京建成生物工程研究所，批號:20100503)，考馬斯亮蘭蛋白測定試劑(南京建成生物工程研究所，批號:20100515)，ALT試劑盒(廣州標(biāo)佳科技公司生產(chǎn)，批號:021129)，AST試劑盒(廣州標(biāo)佳科技公司生產(chǎn)，批號:020926);10%的甲醛由PBS液稀釋得到，其它試劑均為分析純。

1.1.3 儀器。X-22R低溫離心機(jī)(德國BECKMAN公司)，MH2000電子水浴恒溫槽(北京醫(yī)療設(shè)備總廠)，酶標(biāo)儀(BIORAD)，玻璃研磨器(國產(chǎn));CO2培養(yǎng)箱(型號2123TC);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);電子天平(上海菁海儀器有限公司，型號FA2104N);CX9全自動生化分析儀(BECKMAN公司生產(chǎn));微量移液器eppendorf(Made in USA)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝損傷模型制備級分組給藥。實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分成5組，每組12只:①正常組:每天上午、下午分別按照10mL/kg灌胃0.9%生理鹽水;②模型組:每天上午按照10mL/kg灌胃0.9%生理鹽水，下午灌胃10mL/kg，50%的乙醇;③低劑量白藜蘆醇給藥組:每天上午按照10mL/kg灌胃0.02g/kg白藜蘆醇，下午灌胃10mL/kg，50%的乙醇;④中劑量白藜蘆醇給藥組:每天上午按照10mL/kg灌胃0.04g/kg白藜蘆醇，下午灌胃10mL/kg，50%的乙醇;⑤高劑量白藜蘆醇給藥組:每天上午按照10mL/kg灌胃0.08g/kg白藜蘆醇，下午灌胃10mL/kg，50%的乙醇。各組均連續(xù)灌胃10天。

1.2.2 指標(biāo)檢測。上述各組小鼠灌胃期間每天觀察精神活動、毛色、飲食、體質(zhì)量等一般狀態(tài);末次給予乙醇后禁食不禁水12h，稱重，采用摘眼球取血，3000 r/min離心，取血清按試劑盒說明書測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性;取血后頸椎脫臼處死小鼠，迅速取出肝臟稱重(計(jì)算肝指數(shù)=肝重/體質(zhì)量×100%)，左葉用冷生理鹽水制備成100g/L肝勻漿，測定肝勻漿上清液SOD活力及MDA含量，取肝組織勻漿用考馬斯亮蘭蛋白測定法測定蛋白含量;取肝右葉用10%甲醛固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色，觀察其病理變化。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用計(jì)算機(jī)instate件處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用χ2分析方法，P＜0.05表明有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀態(tài) 除正常對照組外，各組小鼠自灌胃乙醇第3天出現(xiàn)易激惹、反抗性增強(qiáng)或減弱、聚堆，部分小鼠出現(xiàn)腹部脹大，進(jìn)食及飲水量減少，毛色無潤澤，稍豎立，隨著灌胃時(shí)間的延長上述現(xiàn)象加重。與模型組比較，不同劑量白藜蘆醇給藥組小鼠一般狀態(tài)有改善，高劑量組更明顯。

2.2 白藜蘆醇對小鼠體重、肝指數(shù)的影響 見表1。由表1可以看出灌胃乙醇可使小鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)降低，與模型組比較，白藜蘆醇各給藥組體質(zhì)量和肝指數(shù)有所增加，且有劑量依賴性。

表1 白藜蘆醇對小鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)的影響(±s，n=12)

表1 白藜蘆醇對小鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)的影響(±s，n=12)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05

肝重指數(shù)正常組組 別 體質(zhì)量(g)灌胃前 灌胃后25.1±1.3 27.4±1.5 47.8±3.2模型組 24.7±1.4 20.1±1.2＊＊ 43.2±5.1＊＊白藜蘆醇-低 24.6±2.0 20.7±1.7＊＊ 44.0±5.6*白藜蘆醇-中 25.0±2.1 21.4±2.3＊＊ 44.6±4.9*白藜蘆醇-高 24.8±1.7 22.3±1.9＊＊△ 45.6±4.7＊△

2.3 白藜蘆醇對小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響見表2。表2結(jié)果顯示，模型組小鼠血清ALT和AST明顯高于正常組，高白藜蘆醇各劑量組血清ALT活力和AST活力顯著低于模型組(P＜0.05，P＜0.01)，高劑量組作用更明顯。

表2 白藜蘆醇對小鼠血清ALT和AST的影響(±s，n=12)

表2 白藜蘆醇對小鼠血清ALT和AST的影響(±s，n=12)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01

組 別 劑量(g/kg) ALT(U/mL) AST(U/mL)28.33±6.83 80.00 ±8.31模型組 65.17±6.02＊＊ 226.67±12.40＊＊白藜蘆醇-低 0.02 59.55±5.27＊＊△ 198.34±13.31＊＊△白藜蘆醇-中 0.04 51.23±4.32＊＊△△ 175.64±12.27＊＊△白藜蘆醇-高 0.08 44.16±4.56＊△△ 151.36±11.14正常組＊＊△△

表3 白藜蘆醇對小鼠肝組織MDA、SOD的影響(±s，n=12)

表3 白藜蘆醇對小鼠肝組織MDA、SOD的影響(±s，n=12)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01

MDA SOD正常組組 別 劑量(g/kg)11.52±1.81 14.22±3.1模型組 18.54±2.52＊＊ 7.68±2.14＊＊白藜蘆醇-低 0.02 17.04±2.17＊＊ 8.56±2.62白藜蘆醇-中 0.04 15.87±2.74＊＊△ 10.97±2.41＊＊△白藜蘆醇-高 0.08 14.13±2.63＊△△ 11.41±2.53＊△△

2.4 白藜蘆醇對小鼠肝組織MDA、SOD的影響 見表3。由表3可見，模型組高肝組織SOD的活性明顯降低，而MDA含量明顯升高;與模型組比較，白藜蘆醇可以顯著提高肝組織SOD的活性和降低MDA的含量，呈明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.5 白藜蘆醇對小鼠肝組織外觀及病理改變的影響 正常對照組肝臟外觀呈紅褐色，質(zhì)地軟而富有彈性;模型組則肝臟表面呈黃褐色，有些呈灰白色，彈性差;白藜蘆醇各給藥組多數(shù)外觀介于對照組與模型組之間。HE染色光鏡下見:正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列規(guī)則，以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，肝細(xì)胞未見異常改變;模型組小鼠肝細(xì)胞索排列紊亂，細(xì)胞可見大小不等、分布不均的脂滴，有空泡樣病變，部分肝細(xì)胞溶解壞死或細(xì)胞核溶解，大量炎細(xì)胞浸潤;白藜蘆醇各給藥組肝組織病理改變有所減輕，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)水腫與脂肪變性，可見點(diǎn)狀壞死，高劑量組有少數(shù)肝細(xì)胞水腫，輕度脂肪變性及壞死。

3 討論

肝臟是酒精的代謝器官，肝細(xì)胞對酒精及其衍生物乙醛的影響極為敏感，過量飲酒可造成肝臟不同程度的損傷。據(jù)統(tǒng)計(jì)，重度飲酒精者中90% ～100%有一定程度的脂肪肝，10% ～35%可發(fā)展成酒精性肝炎，8% ～20%將發(fā)展為肝硬化［7］。

酒精在肝細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生過多的氧應(yīng)激產(chǎn)物，如OH-、O2-，H2O2等自由基。這些自由基可激活磷脂酶及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低膜磷脂，改變其通透性和流動性，從而改變與膜結(jié)合的酶、受體和離子通道的微環(huán)境，影響其功能。因此，血清轉(zhuǎn)氨酶活性升高是肝細(xì)胞受損的敏感性指標(biāo)［8］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠血清ALT、AST活性與正常對照組相比明顯升高，白藜蘆醇可呈劑量依賴性明顯降低血清ALT、AST活性，說明白藜蘆醇對乙醇誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

MDA作為過氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，是細(xì)胞氧化損傷的一個(gè)重要檢測指標(biāo)。MDA可與磷脂酰乙醇胺和蛋白質(zhì)交聯(lián)，生成無活性脂褐質(zhì)，沉積于組織細(xì)胞，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞無法維持正常代謝而死亡［9］。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，與模型組比較，白藜蘆醇各劑量組血清與肝臟組織中MDA含量均明顯減少，而且高劑量白藜蘆醇組效果更佳，說明白藜蘆醇可使酒精所致急性肝損傷模型小鼠的MDA含量升高。并呈明顯量效關(guān)系。

SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶之一，酒精的攝入使其活性減弱，引起不飽和脂肪酸氧化生成過氧化物，形成脂褐質(zhì)以及使DNA、蛋白質(zhì)和酶等改變、破壞，從而加速肝臟損傷［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，白藜蘆醇各劑量組小鼠血清與肝臟組織中SOD活性均明顯增強(qiáng)。由此可推斷白藜蘆醇可以抑制酒精所致急性肝損傷模型小鼠SOD活性的降低，并呈明顯量效關(guān)系。產(chǎn)生上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能是由于白藜蘆醇能清楚氧自由基，減輕炎性反應(yīng)，抗脂質(zhì)過氧化損傷，從而起到了保護(hù)酒精性肝損傷的作用。

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