松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠腸道抗氧化能力及通便作用的影響

張晉蔚，錢(qián) 江，何玉巧，楊麗華，林楚慧，鄭文瑋，王 響，胡滿(mǎn)江，陳驍熠

(廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州510182)

慢性便秘是臨床常見(jiàn)的復(fù)雜癥狀，長(zhǎng)期便秘造成有害物質(zhì)在腸道堆積，產(chǎn)生過(guò)量的自由基、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子［1］使腸黏膜受損甚至誘發(fā)心腦血管疾病、結(jié)直腸癌等嚴(yán)重的并發(fā)癥。流行病學(xué)調(diào)查表明，受慢性便秘影響的人群已經(jīng)高達(dá)20%［2］，尤其多見(jiàn)于中老年人和體弱多病者［3］。天然產(chǎn)物相對(duì)于藥物在治療慢性便秘中具有毒副作用小、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，然而傳統(tǒng)用于通便的大黃和番瀉葉如果長(zhǎng)期使用容易引起結(jié)腸黑變病和增加患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)［4］。因此，探求一種長(zhǎng)期有效且無(wú)毒副作用的天然產(chǎn)物具有重要意義。

腸道粘膜是抵御有害物質(zhì)氧化損傷的第一道屏障［5］，因此增強(qiáng)腸道粘膜的抗氧化能力是治療慢性便秘的重要手段。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素等黃酮類(lèi)化合物能夠通過(guò)抗氧化作用改善小鼠腸粘膜的氧化損傷［6］。松針食用歷史悠久［7-8］，安全性高［9］，其中的黃酮類(lèi)化合物、胡蘿卜素、原花青素等天然抗氧化劑能夠清除自由基，增強(qiáng)抗氧化能力［10-11］，保護(hù)腸黏膜，維持腸道功能?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明松針的抗氧化性對(duì)心血管疾病［12］、糖尿病［13］、腫瘤［14］等慢性疾病有積極的防治作用，但對(duì)其通便功能鮮有報(bào)道。本研究擬通過(guò)評(píng)價(jià)腸道抗氧化能力和通便作用等方面考察松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠的影響，以期增加松針開(kāi)發(fā)利用的附加值，并為治療慢性便秘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

復(fù)方地芬諾酯片 長(zhǎng)春長(zhǎng)紅制藥有限公司;馬尾松松針 采自湖北;大黃 購(gòu)于大參林藥房;復(fù)方地芬諾酯片 江蘇康普藥業(yè);丙二醛(MDA)試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、一氧化氮(NO)試劑盒 均購(gòu)于南京建成生物工程研究所;其它試劑 均為分析純;昆明小鼠，雄性，SPF級(jí)，體重(18～22g) 由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

AK-98超細(xì)中藥粉碎機(jī) 溫嶺市奧力;DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科技;X-22R低溫臺(tái)式高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司;UV-3900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本日立。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 松針提取液的制備 稱(chēng)取新鮮松針，洗凈，剪成0．5～1cm長(zhǎng)，粉碎松針至可通過(guò)20目篩后，稱(chēng)取松針?lè)?60、3、1．5g于燒瓶中，加入 60mL 蒸餾水，在90℃條件下熱浸提120min，冷卻后減壓抽濾，分別得到 1∶1、1∶20、1∶40(g∶mL)松針提取液。大黃磨粉后，以1∶20(g∶mL)料液比在松針提取液相同條件下浸提制得大黃提取液。

1．2．2 動(dòng)物分組及處理 將76只健康昆明小鼠隨機(jī)分成空白組與便秘組，空白組給予生理鹽水，便秘組給予復(fù)方地芬諾酯(5mg/kg BW)造模。兩周后，測(cè)定兩組小鼠體重及結(jié)腸丙二醛(MDA)含量。再將便秘組按體重隨機(jī)分成便秘組、1∶1、1∶20 和 1∶40 松針組、1∶20大黃組，便秘組給予生理鹽水，其余各組給予相應(yīng)提取液進(jìn)行干預(yù)，共10d。各組小鼠在第7d進(jìn)行通便作用評(píng)價(jià)，第10d處死小鼠，取出樣本進(jìn)行測(cè)定。

1．2．3 小鼠通便作用的評(píng)價(jià) 第6d干預(yù)后，各組小鼠禁食不禁水16h，各小鼠給予等量墨汁灌胃，立即放至鋪有濾紙的鼠籠內(nèi)，每籠小鼠1只，并恢復(fù)飼料和飲水，同時(shí)開(kāi)始準(zhǔn)確計(jì)時(shí)。觀察記錄每只小鼠首粒黑便排出用時(shí)，并連續(xù)觀察5h，記錄5h小鼠黑便的粒數(shù)，同時(shí)記錄黑便的性狀，并及時(shí)稱(chēng)量排出黑便的濕重。

1．2．4 小鼠結(jié)腸丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性的測(cè)定 末次干預(yù)1h后，眼球取血，靜置2h 后，3500r/min，4℃離心 15min，制備血清，檢測(cè)血清中NO的含量。剖開(kāi)處死后小鼠的腹腔，分離腸系膜，剪取距離回盲部1cm處大腸組織2cm，按照試劑盒提供方法測(cè)定其 MDA、NO的含量和SOD、GSH-Px的活性。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò) SPSS20．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組計(jì)量資料的描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，使用單因素方差分析(ANOVA)及Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較，p＜0．05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢性便秘對(duì)小鼠體重及結(jié)腸MDA含量的影響

由表1可知，與空白組比較，造模兩周后，便秘組體重明顯減輕(p＜0．05)，說(shuō)明慢性便秘會(huì)造成小鼠體重減輕。而便秘組MDA含量與空白組比較明顯升高(p＜0．01)，表明慢性便秘能夠增加結(jié)腸組織氧化程度。

表1 慢性便秘對(duì)小鼠體重及結(jié)腸MDA含量的影響(±s，n=8)Table 1 The effect of chronic constipation on body weight and colonic MDA content(±s，n=8)

表1 慢性便秘對(duì)小鼠體重及結(jié)腸MDA含量的影響(±s，n=8)Table 1 The effect of chronic constipation on body weight and colonic MDA content(±s，n=8)

注:與空白組比較，*p ＜0．05，＊＊p ＜0．01。

組別 體重(g) 結(jié)腸MDA含量(nmol/mL)34．15 ± 1．55 0．76 ± 0．40便秘組 31．23 ± 1．44* 1．62 ± 0．44空白組＊＊

2.2 松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠結(jié)腸MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響

如表2所示，與空白組比較，便秘組的MDA含量顯著增加，SOD與GSH-Px活性顯著降低(p＜0．01)。說(shuō)明在停藥10d后，便秘小鼠腸道的氧化程度仍比正常小鼠高，而抗氧化酶活性降低。與便秘組比，各提取液均能顯著降低結(jié)腸組織的MDA含量(p＜0．01)，三組松針提取液均能顯著提高SOD活性(p＜0．05)，而大黃提取液能提高SOD活性，但差異不顯著。研究顯示只有1∶1松針提取液能顯著提高GSH-Px的活性(p＜0．01)，其余各組效果不顯著。結(jié)果說(shuō)明松針提取液能夠提高結(jié)腸抗氧化能力，減少結(jié)腸的氧化損傷。

表2 松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠結(jié)腸MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響(±s，n=10)Table 2 The effect of pine needle extract on antioxidant capacity of chronic constipated mice(±s，n=10)

表2 松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠結(jié)腸MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響(±s，n=10)Table 2 The effect of pine needle extract on antioxidant capacity of chronic constipated mice(±s，n=10)

注:與空白組比較，*p＜0．05，＊＊p ＜ 0．01;與模型組比較，#p ＜0．05，##p ＜0．01，表 3，表 4 同。

組別 MDA含量(nmol/mL)SOD活性(U/mL)GSH-Px活性(U/mL)2．61 ± 1．11 22．22 ± 6．14 41．47 ± 18．40便秘組 5．58 ±2．25＊＊ 14．02 ±2．73＊＊ 35．93 ±14．02＊＊1∶20 大黃 1．94 ± 0．40## 16．73 ± 0．93 30．68 ± 15．19 1∶40 松針 2．55 ± 1．28## 22．46 ± 5．83## 48．40 ± 19．31 1∶20 松針 3．22 ± 1．10## 22．45 ± 7．26# 45．09 ± 15．37 1∶1 松針 2．84 ± 0．91## 24．95 ± 9．77## 55．28 ± 11．93空白組##

2.3 松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠排便的影響

由表3可知，與空白組比較，便秘組小鼠首粒黑便排出用時(shí)明顯延長(zhǎng)，5h內(nèi)黑便粒數(shù)和黑便重量明顯減少，結(jié)果均具有顯著性差異(p＜0．05)，且經(jīng)過(guò)7d停灌復(fù)方地芬諾酯，便秘小鼠的排便功能仍得不到改善，說(shuō)明慢性便秘小鼠模型穩(wěn)定。與模型組比較，1∶40松針提取液對(duì)黑便重量增加不顯著(p＞0．05)但可以減短首粒黑便排出用時(shí)及增加粒數(shù)(p＜0．05)，其余各提取液均能明顯縮短便秘小鼠首粒黑便排出用時(shí)(p＜0．01)，增加5h內(nèi)黑便的粒數(shù)和重量(p＜0．05)。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)松針和大黃提取液干預(yù)后，小鼠便秘得到緩解。

表3 松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠排便的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on laxative activity of chronic constipated mice(±s，n=10)

表3 松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠排便的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on laxative activity of chronic constipated mice(±s，n=10)

組別 首粒黑便排出用時(shí)(min)黑便粒數(shù)(粒)黑便重量(mg)84．22 ± 22．83 13．75 ± 6．43 455．07 ± 28．19便秘組 121．80 ±35．75＊＊ 8．17 ±4．31* 365．04 ±124．75*1∶20 大黃 95．85 ± 16．13# 17．00 ± 4．29## 461．80 ± 63．00#1∶40 松針 85．52 ± 10．61## 13．17 ± 4．12# 435．08 ± 35．15 1∶20 松針 65．14 ±15．57## 14．33 ±3．98# 444．53 ±21．62#1∶1 松針 69．93 ± 28．75## 14．83 ± 4．07# 459．38 ± 46．51空白組#

2.4 松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠血清及結(jié)腸NO含量的影響

表4結(jié)果顯示，便秘小鼠血清和結(jié)腸中NO的含量均比空白組顯著升高(p＜0．01);各劑量組與便秘組相比，均能顯著降低便秘小鼠中血清與結(jié)腸中NO的含量。說(shuō)明松針與大黃皆能減少NO的產(chǎn)生和作用。

表4 松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠血清及結(jié)腸NO含量的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on serum and colonic NO content of chronic constipated mice(±s，n=10)

表4 松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠血清及結(jié)腸NO含量的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on serum and colonic NO content of chronic constipated mice(±s，n=10)

組別 血清NO含量(μmol/g)結(jié)腸NO含量(μmol/g)12．95 ± 5．60 4．70 ± 0．62便秘組 40．09 ±7．13＊＊ 20．19 ±13．51＊＊1∶20 大黃 21．02 ± 5．79## 14．63 ± 6．37#1∶40 松針 23．16 ± 6．79## 13．99 ± 5．32#1∶20 松針 30．87 ± 11．15## 10．63 ± 6．10##1∶1 松針 21．56 ± 11．54## 4．85 ± 4．32空白組##

3 討論

3.1 小鼠慢性便秘致氧化損傷模型的建立

為研究慢性便秘對(duì)腸道的氧化作用，本研究參考劉海峰［15］，包云光［16］，智會(huì)［17］等使用大鼠造模方法，成功得到穩(wěn)定的小鼠慢性便秘模型，并首次檢測(cè)到結(jié)腸的MDA含量升高(p＜0．01)(表1)，結(jié)果證明慢性便秘可以造成腸道的氧化損傷。這可能由于小鼠服用復(fù)方地芬諾酯后，抑制了腸道蠕動(dòng)功能，使腸內(nèi)容物長(zhǎng)時(shí)間停留在腸道內(nèi)。腸內(nèi)容物中的有害物質(zhì)如吲哚、亞硝胺、酚類(lèi)等長(zhǎng)時(shí)間對(duì)腸黏膜造成刺激，產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)、自由基等［1］不斷攻擊腸道上皮黏膜、使腸黏膜受到氧化損傷，進(jìn)而影響腸道的消化及代謝功能，最后導(dǎo)致體重減輕(p＜0．05)(表 1)。

3.2 松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠氧化損傷的干預(yù)作用

本實(shí)驗(yàn)對(duì)慢性便秘小鼠進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，不同濃度的松針提取液均能明顯增強(qiáng)結(jié)腸的抗氧化能力。松針提取液富含蘆丁、槲皮素、葉綠素等多種抗氧化物質(zhì)，能夠調(diào)劑體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)［18］，加快自由基的清除，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。同時(shí)，松針提取液也可以通過(guò)明顯提高SOD的活性(p＜0．05)(表2)，增強(qiáng)便秘小鼠腸道內(nèi)源性抗氧化能力，使腸道免受自由基的損傷［10］。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，不同濃度的松針提取液均能夠降低體內(nèi)NO的水平減少腸道的氧化損傷。NO亦屬于自由基。便秘小鼠腸道內(nèi)的有害物質(zhì)會(huì)促使腸道菌群產(chǎn)生過(guò)量的內(nèi)毒素，進(jìn)而激活巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO［19］。而過(guò)量的NO能夠?qū)е录?xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡，從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［20］，損傷腸黏膜，降低腸道功能。在松針提取液干預(yù)后，便秘小鼠血清和結(jié)腸中的 NO含量明顯減少(p＜0．05)(表4)，小鼠的腸道損傷明顯降低。

3.3 松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠通便功能的影響

從表3看出松針提取液能夠明顯縮短便秘小鼠排首粒黑便的用時(shí)，并能夠增加排黑便的粒數(shù)和濕重。表明經(jīng)過(guò)松針提取液干預(yù)后，腸道功能得到一定程度恢復(fù)，便秘癥狀得到緩解。本實(shí)驗(yàn)中，由于三組松針是在不同料液比的條件下進(jìn)行提取，各提取液中活性物質(zhì)的含量和組成各不相同，因此對(duì)小鼠體內(nèi)的抗氧化活性和排便的效果也有所不同。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)使用松針提取液對(duì)慢性便秘小鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)松針提取液能夠緩解慢性便秘致小鼠結(jié)腸的氧化損傷，提高腸道的抗氧化能力，進(jìn)而改善小鼠的通便功能。本研究為開(kāi)發(fā)松針通便功能性食品提供了理論依據(jù)。

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