響應面法優(yōu)化表面活性劑/微波輔助提取海紅果渣中果膠的工藝

劉慧瑾，杜芳艷，高立國，代 帥

(榆林學院化學與化工學院，陜西榆林719000)

果膠是人體七大營養(yǎng)素中膳食纖維的主要成分，具有良好的抗腹瀉、抗癌、治療糖尿病降血脂、止血、消腫、解毒和減肥等功效，是公認安全的食品添加劑。果膠的需求量呈高速增長態(tài)勢［1］。果膠的提取方法有微波法［2-3］、超聲波法［4］、酶法［5］、離子交換法［6］、膜分離法［7］、鹽析法［8］、微生物法［9］等。表面活性劑具有特殊的兩親結(jié)構(gòu)，可形成分子液膜萃取，增加液固接觸面積，增強溶劑對物料的潤濕性和滲透性;另外，表面活性劑具有顯著的降低表面張力的能力，它的許多應用都與此特性有關，例如分散、潤濕、滲透和鋪展作用;由于表面活性劑降低了細胞膜與水溶液間的界面張力，有利于水溶液通過毛細管滲透進入細胞壁內(nèi)，溶解更多有效成分，且物料更易被溶劑分散、潤濕和鋪展開來，增加了有效成分的溶出幾率;當表面活性劑存在于界面時還表現(xiàn)出一定的吸附作用;表面活性劑的這種特性，使得其在提取分離中能增加浸出效能和萃取率，在天然產(chǎn)物提取中得到應用。利用微波加熱能破壞原料的薄壁組織細胞，提高組織細胞的多孔滲透性和吸水能力。將微波和表面活性劑兩者的功能結(jié)合起來，起到協(xié)同作用，可降低成本，提高萃取效率。表面活性劑增效提取果膠的研究已有報道［10］，但應用表面活性劑增效與微波輔助技術提取果膠的研究未見報道。海紅果為薔薇科植物海紅子(Malus micromalus)的果實，學名西府海棠［11］，是我國稀有果樹資源。我們采用表面活性劑/微波輔助技術提取海紅果渣中的果膠，通過響應面法對提取工藝進行優(yōu)化，以求為海紅果的開發(fā)利用提供技術支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海紅果 采自陜西省府谷縣。

十二烷基硫酸鈉(SDS) 西安化學試劑公司;無水乙醇;D-半乳糖醛酸對照品 中國藥品及生物制品鑒定所;咔唑 阿拉丁試劑網(wǎng);所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

MDS-8型多通量密閉微波化學工作站 上海新儀微波化學科技有限公司;電子分析天平沈陽龍騰電子有限公司;722S型可見分光光度計 上海箐華科技儀器有限公司;80-2型電動離心機 江蘇環(huán)宇科學儀器廠;pHS-3C型酸度計 上海理連儀器廠;101-1型數(shù)顯電熱鼓風干燥箱 上海恒一科學儀器有限公司;FZ102型粉碎機 北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 海紅果去除果肉部分，果核放入烘箱內(nèi)于60℃下烘干，粉碎，過60目篩得果渣粉，果渣粉用90℃水(料液比為1∶20)煮10min，使果膠酶失去活性，冷卻過濾，濾渣用35℃的溫水沖洗，至濾液為無色，以除去濾渣中的糖類、色素等雜質(zhì)，60℃下干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 果膠提取工藝 稱取2.000g果渣粉，按照1∶15(g/mL)的料液比，加入0.8%的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液，用0.05mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH2.0，在50℃下，于MDS-8型多通量密閉微波化學工作站中提取14min，過濾，重復提取兩次，合并濾液，濾液定容至100mL得樣品儲備液。

1.2.3 標準曲線與果膠含量的測定 以D-半乳糖醛酸為標準品繪制標準曲線，采用咔唑-硫酸分光光度法測定［12］。準確量取樣品儲備液10.0mL于50mL燒杯中，加入1.0mol/L硫酸溶液6.0mL，在70℃水浴中加熱20min進行水解，水解物冷卻至室溫后移入50mL容量瓶，水稀釋定容，得到樣品溶液。準確移取樣品溶液10.0mL并定容到50mL，移取稀釋后的樣品溶液1.0mL于試管中，加入濃硫酸6.0mL，邊加邊流水冷卻，冷至室溫后加入0.15%的咔唑無水乙醇溶液0.50mL，搖勻，在室溫下暗處放置30min后，以試劑空白為參比，在530nm處測定其吸光度。樣品中的果膠物質(zhì)總含量以半乳糖醛酸表示:

果膠得率(%)=c×50×50×10-6/W×100

式中:c為從標準曲線查得的所測果膠液中的半乳糖醛酸的濃度(mg/L);W為樣品的質(zhì)量，g。取8支50mL 比色管，依次加入濃度為 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL 的半乳糖醛酸標準溶液1.0mL，按實驗方法進行測定，以吸光度為縱坐標，半乳糖醛酸濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.4 單因素實驗 按照1.2.2方法，采用單因素輪換實驗分別考察pH、提取時間、料液比、表面活性劑用量、提取溫度對果膠得率的影響，確定各因素的最佳范圍。

1.2.5 響應面法組合設計工藝優(yōu)化實驗 在單因素實驗結(jié)果的基礎上，確定采用質(zhì)量分數(shù)為0.8%的SDS為溶劑，微波提取功率為700W，溫度為50℃，同法提取兩次，選取溶劑的pH A、微波提取時間B及料液比C三個對海紅果渣中果膠得率影響較大的主要因素進行優(yōu)化實驗。以海紅果渣中果膠得率R1為目標，使用中心組合實驗設計和響應面分析法，在三因子三水平上對提取工藝進行優(yōu)化。實驗因子和水平見表1。通過Design Expert 8.0.6軟件分析對實驗進行回歸分析，預測提取果膠的最優(yōu)工藝參數(shù)。

表1 響應面實驗因素水平編碼Table 1 Levels and factors of the Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 半乳糖醛酸標準曲線

在0～100.0mg/L范圍內(nèi)，吸光度和半乳糖醛酸的濃度呈良好的線性關系(誤差量＜±0.05)，見圖1?；貧w方程為:A=0.0115c+0.0204(R2=0.9993)。式中:A為波長530nm處的吸光度;c為D-半乳糖醛酸的含量(mg/L)。

圖1 半乳糖醛酸標準曲線Fig.1 Egression curve of galaturonic acid

2.2 單因素實驗

pH對果膠得率的影響:固定提取溫度50℃、SDS濃度為 0.8%，選用料液比 1∶20，微波輔助提取10min，微波功率700W，考察不同pH對果膠得率的影響，結(jié)果如圖2所示，當pH＜2.0時，果膠得率隨pH增大而增加，在pH為2.0時果膠的得率達到最大，pH繼續(xù)增大時果膠得率下降，這是因為酸性過低，果膠不穩(wěn)定，逐步水解成單糖，而酸度過大對果膠分子甙鍵及酯鍵破壞大，果膠發(fā)生脫酯裂解，導致果膠得率下降。所以pH為2.0較合適。

微波時間對果膠得率的影響:固定提取溫度50℃、SDS濃度為0.8%，選用料液比1∶20，pH 為2.0，微波功率700W，考察不同微波輔助提取時間對果膠得率的影響，結(jié)果如圖3所示，在微波提取時間低于12min時，果膠得率隨著提取時間的增加而增大，在12min時果膠得率最大，時間大于12min時，再增加提取時間，果膠的得率反而下降。這一方面是因為微波作用于細胞壁，破壞原料的薄壁組織細胞，促進細胞間果膠的釋放，另一方面是由于表面活性劑的吸附量在吸附初期，隨時間平方根成正比，且隨濃度增大而增加，吸附量增大，表面張力降低，有利于果膠的溶出。但處理時間過長，表面吸附經(jīng)過一定時間達到了飽和吸附量，表面張力基本不變［13］，而微波產(chǎn)生的高溫又會使果膠中的半乳糖醛酸分解，從而使果膠得率下降。

圖2 pH對果膠得率的影響Fig.2 Effect of pH value on the yield of pectin

圖3 提取時間對果膠得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of pectin

料液比對果膠得率的影響:固定提取溫度50℃、SDS濃度為0.8%，pH為2.0，微波功率700W，微波輔助提取時間12min，考察不同料液比對果膠得率的影響，結(jié)果如圖4所示，當料液比為1∶15時果膠得率最大，料液比過小時，不利于果膠質(zhì)水解成果膠，溶液中含有的果膠濃度低。料液比過大時，稀釋了提取物的濃度，提取量反而下降，并且由于其他物質(zhì)的溶出，造成過濾困難。

圖4 料液比對果膠提取率的影響Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the yield of pectin

SDS濃度對果膠得率的影響:固定提取溫度50℃、料液比 1∶15(g/mL)，pH 為 2.0，微波功率700W，微波輔助提取時間14min，考察SDS濃度對果膠得率的影響，結(jié)果如圖5所示，當SDS濃度小于0.4%時得率隨濃度增加而增大，在0.8% 時，果膠得率最大。果膠得率提高的原因其一是表面活性劑形成分子液膜萃取，增加液固接觸面積，其二是因為表面活性劑特定的雙親結(jié)構(gòu)，具有分散、滲透、潤濕等作用，可降低細胞膜與水溶液間的界面張力，有利于水溶液通過毛細管滲透進入細胞壁內(nèi)，溶解更多的果膠，且在小于臨界膠束濃度時，表面張力隨著表面活性劑濃度的增加而降低，因此果膠得率隨著SDS濃度的增加而增大。當SDS濃度大于0.4%時，增大SDS的濃度，果膠得率總體變化不是很大。這是因為當表面活性劑濃度達到臨界膠束濃度后，表面張力隨表面活性劑濃度的增加變化很小甚至不變［13］。因此果膠得率沒有太大的增加。實驗選擇SDS濃度為0.8%。

圖5 SDS濃度對果膠得率的影響Fig.5 Effect of SDS concentration on the yield of pectin

微波提取溫度對果膠得率的影響:固定SDS濃度為0.8%，選用料液比1∶15，pH為2.0，微波輔助提取時間12min，考察提取溫度對果膠得率的影響，結(jié)果如圖6所示，當溫度低于45℃時，隨著溫度的升高，果膠迅速溶解，果膠得率隨之而增大，溫度在45℃～65℃果膠溶解速率達到最大，果膠得率達到最高且隨溫度變化不大，當溫度高于70℃時，由于果膠耐熱性較差，發(fā)生水解成單糖，導致果膠得率隨溫度升高而降低。

圖6 提取溫度對果膠提取率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on the yield of pecti

2.3 響應面實驗結(jié)果及分析

以果膠得率R1為響應值，以溶劑的pH A、提取時間 B、料液比 C為主要影響因素，根據(jù) Box-Behnken的原理，由實驗水平因素編碼進行實驗設計，實驗結(jié)果見表2。對表2中實驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸擬合，得到的回歸方程為:R1=16.16+0.39A+0.29B-0.075C-0.050A·B-0.18A·C+0.42B·C-0.96A2-0.86B2-0.68C2。

表2 響應面分析方案及實驗結(jié)果Table 2 Program and test results of response surface analysis

回歸統(tǒng)計分析結(jié)果見表3。擬合方程的每個變量對響應值影響的顯著程度，可以通過p值來判斷［14］。p值越小則表示對應變量的影響顯著性越高，當p≤0.05時為顯著水平，當p≤0.01時為水平極顯著。由表3可知，二次回歸模型的F=63.65，其(p＞F)值小于0.0001則表示二次回歸模型具有顯著性。失擬項F=263，p=0.1868＞0.05，說明實驗設計擬合效果好，實驗設計合理。模型二次項A2、B2、C2與影響因素 A、B以及交互項 BC均具有極顯著性(p＜0.01)，其他因素不顯著。說明pH、提取時間在本實驗中的影響是極其重要的。BC兩個因素的交互作用對果膠得率有較大的影響。由此可以看出，回歸模型不是簡單的線性關系。各因素對提取海紅果渣果膠得率的影響大小順序為:溶劑pH＞提取時間＞料液比。模型調(diào)整確定系數(shù)R2=0.9573，說明該模型能較好的解釋響應值的變化。

由二次回歸模型得出以下三個響應曲面圖，見圖7～圖9，分析圖可以了解以下因素對響應目標(海紅果渣果膠得率)的影響和各個因素間的交互作用。由圖可以看出，響應曲面均是開口向下的凸面，且其中心位于所考察區(qū)域內(nèi)，說明在考察的區(qū)域范圍內(nèi)存在響應值的最大值，通過軟件分析，表面活性劑SDS/微波輔助提取海紅果渣中果膠的最佳條件為:表面活性劑SDS的濃度為0.8%的條件下，控制溶劑的pH為2.04，提取時間 14.3min，料液比為 1∶14.8(g/mL)，海紅果渣中果膠的得率為16.22%。

圖7R1=(A，B)的響應面圖Fig.7 Response surface plot of R1between A and B

2.4 驗證實驗

對優(yōu)化所得實驗方案進行驗證，即采用0.500g海紅果渣，按照1∶15(g/mL)的料液比，加入0.8%SDS溶液，用0.05mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH2.0，控制微波溫度50℃，微波提取時間為14min，重復提取兩次。進行5次平行實驗求平均值。結(jié)果海紅果渣中果膠得率為16.1%。與模型預測值之間的誤差為-0.12%。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression Model

圖8 R1=(A，C)的響應面圖Fig.8 Response surface plot of R1between A and C

圖9 R1=(B，C)的響應面圖Fig.9 Response surface plot of R1between B and C

3 結(jié)論與討論

一定濃度的表面活性劑SDS具有分散、滲透、潤濕等作用，增加液固接觸面積，有效降低界面張力，從而促進果膠的充分溶出。

海紅果渣中含有一定量的果膠，采用響應面法所得到的實驗模型可靠，具有一定實用價值，其優(yōu)化的提取工藝條件是:按照1∶15(g/mL)的料液比，加入0.8%SDS溶液，用0.05mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH2.0，控制微波溫度50℃，微波提取時間為14min，重復提取兩次。進行5次平行實驗求平均值。結(jié)果海紅果渣中果膠得率為16.1%。

采用表面活性劑SDS/微波輔助法提取果膠，將微波和表面活性劑兩者的功能結(jié)合起來，起到協(xié)同作用，可以顯著提高海紅果渣中果膠得率，而且提取時間短，溫度低，可降低成本。

［1］潘虹.從不同原料中提取果膠工藝的研究綜述［J］.安徽農(nóng)學通報，2009，30(15):73-79.

［2］M.Kratchanova，E.pvalova，I Panchev.The effect of microwave heating of fresh orange peels on the fruit tissue and quality of extraction pectin［J］.Cabohydratepolymers，2004，(56):181-185.

［3］張帥，董基，黃志明，等.微波輔助提取黃皮果肉果膠工藝參數(shù)優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2012，28(15):264-268.

［4］岳賢天.超聲波輔助提取蘋果皮中果膠的工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39(5):32-35.

［5］韓冬梅，廖小軍，李淑艷，等.酶法制取橙皮果膠的研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，3(2):183-186.

［6］顧焰波，陳冬年，倪秋萍，等.離子交換法提取香蕉皮果膠工藝研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2013，14:111-113.

［7］鄭領英.膜技術［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2000:15-17.

［8］孔 瑾，李新錚，常景玲，等.鹽析法從干南瓜皮中提取果膠的技術研究［J］.食品研究與開發(fā)，2005，26(1):69-71.

［9］Takuo S M，Masaru N.Reach on protopectinase:A new aspect of research on pectolytic enzymes［J］.Mere.Fac.Agric.Kinki.Unic，1999，19(1):32

［10］岳賢田.表面活性劑增效超聲波輔助提取香蕉皮中果膠的研究［J］.農(nóng)業(yè)機械，2011，12:145-147.

［11］王菱.晉陜蒙三角區(qū)特有果樹——海紅子［J］.自然資源，1990，3(1):48.

［12］丁建東，張雪紅，姚先超，等.咔唑比色法測定劍麻果膠含量［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31(11):138-140.

［13］劉程.表面活性劑應用大全［M］.北京:北京工業(yè)大學出版社，1994:59-64.

［14］Shengli Y，Hui Z.Optimization of cholesterol oxidase production by Brevibacterium sp-employing response surface methodology［J］.African Journal of Biotechnology，2012，24(1):90-94.