灘涂植物堿蓬籽中總酚的提取工藝優(yōu)化

王新紅，王京平，朱 瑋

(江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點實驗室，江蘇鹽城師范學院化學化工學院，江蘇鹽城224051)

堿蓬(SuaedaglaucaBge)是蔾科(Chenopodiaceae)堿蓬屬(Suaeda)植物［1］，常稱為“海英菜”、“堿蒿”、“鹽蒿”，是典型鹽生植物［2］。堿蓬的鮮嫩莖葉營養(yǎng)豐富，籽粒的脂肪含量高達36.4%，遠高于大豆(18.8%)［3］。另外，堿蓬的莖葉中含有大量的人體所必需的氨基酸、維生素、胡蘿卜素和 Cu、Zn、Ca、Fe、Mn、P、Se 等微量元素［3-4］，其中有許多指標都高于螺旋藻。此外也可做動物飼料［5］，可做肥皂、油漆，可用于印染、玻璃工業(yè)等［6］，是化學工業(yè)的原料。綜上可見，在食用、保健、藥用方面，堿蓬的研究和開發(fā)價值很大，由此也引起了許多學者的關注［7-9］，經(jīng) SCI和 EI數(shù)據(jù)庫檢索，及國內 CNKI檢索結果發(fā)現(xiàn)，涉及堿蓬的相關研究主要是堿蓬中的黃酮類物質［7］、蛋白［8］、甜菜紅素［9］、多糖［10］等的提取研究，但未見有對堿蓬中總酚的提取及工藝優(yōu)化方面的相關報道。

本實驗通過超聲提取的方法從堿蓬籽中提取總酚［11］，研究在不同的溫度、不同的提取時間、不同的料液比及不同的乙醇的體積分數(shù)下的總酚的含量(total phenolic content，TPC)，通過響應面分析法優(yōu)化［12］并確定最佳工藝參數(shù)，獲得回歸模型，并驗證。為堿蓬在食品、醫(yī)藥、化學工業(yè)等行業(yè)的進一步分析、開發(fā)及應用提供理論基礎和應用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福林酚試劑、沒食子酸、無水乙醇、碳酸鈉 上海國藥集團;其他試劑均為分析純。實驗用水均為二次蒸餾水。堿蓬籽于2012年10月在鹽城大豐海堤采摘，清洗后在60℃下烘干至恒重，粉碎后過60目篩，密封放置4℃的條件下待用。

SPECORD-50紫外分光光度計 德國耶拿公司;KQ-300E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;SHB-IIIT循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線及總酚的測定 根據(jù)文獻［12］的方法，稍作修改:精確稱取0.100g沒食子酸，加蒸餾水定容至100mL，分別移出 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL 至100mL 容量瓶，濃度為 0、10、20、30、40、50、60、70μg/mL沒食子酸溶液。再取1mL各濃度沒食子酸溶液，加入1mL福林酚試劑(1∶1)，然后加入3mL 7.5%碳酸鈉溶液，在 25℃下反應 30min，在765nm下測定吸光度值。以吸光度A和沒食子酸溶液濃度進行線性擬合，得線性回歸方程:y=0.019x+0.1707，R2=0.9912，其中 x 是食子濃度(μg/mL)，y值是吸光度A。與上述方法同，測定不同工藝得到的堿蓬籽提取液的吸光度A，總酚的提取量則可根據(jù)下式進行計算:TPC(μg/g)=(A-0.1707)(料液的體積(mL)/［0.019(堿蓬樣品的質量(g)］。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 乙醇體積分數(shù)的選擇 準確稱取1.000g研磨后的堿蓬籽置于25mL容量瓶中，按料液比1∶20，分別加入濃度為30%、50%、70%、90%、100%的乙醇20mL，提取2次，每次取一半體積的溶劑提取，兩次提取液合并后離心，取出上層清液1mL，測定溶液中總酚的含量，從而選擇總酚含量最高的乙醇體積分數(shù)進行后序實驗。

1.2.2.2 提取時間的選擇 按料液比1∶20加入90%的乙醇，在 40℃超聲儀中分別浸提 0.5、1.0、1.5、2.0h，提取2次，每次取一半體積的溶劑提取，兩次提取液合并后離心，取上層清液1mL，測定溶液中總酚的含量，從而選擇最佳的提取時間。

1.2.2.3 提取溫度的選擇 按料液比1∶20加入90%的乙醇，分別在 20、40、60、80℃超聲儀中浸提 30min，提取2次，每次取一半體積的溶劑提取，兩次提取液合并后離心，取上層清液1mL，測定溶液中總酚的含量，從而選擇最佳的提取溫度。

1.2.2.4 料液比的選擇 原料按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 加入 90%乙醇，在 80℃ 條件下浸提 1h，提取次數(shù)為2次，合并兩次提取液，離心后，取上層清液，測定溶液中總酚的含量，從而選擇最佳的料液比。

1.2.3 響應面分析 根據(jù)單因素實驗的結果，選取依照響應面分析法中的Box-Behnken Design中心組合法設計并優(yōu)化提取工藝。以總酚提取量為響應值，4因素3水平的實驗設計見表1。實驗數(shù)據(jù)的處理均采用Design Expert7.1.6軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 乙醇體積分數(shù) 根據(jù)實驗方法1.2.2中的單因素實驗方法研究不同的乙醇體積分數(shù)對堿蓬中總酚提取量的影響實驗，在40℃的溫度下，時間為30min，料液比為1∶20的提取條件下，結果如圖1。由圖1可見，堿蓬中的總酚的提取量隨著乙醇濃度的升高而增加，當乙醇濃度達到90%，總酚的提取量達到此時提取條件下的最大值，這是由于有機溶劑乙醇量的增加抑制了多酚與植物基質中其他組分的反應而提高了多酚的溶出率，繼續(xù)升高乙醇濃度，總酚提取量增長的幅度下降。這可能與溶劑中乙醇量加大，而水含量減小引起了水溶性的酚類物質的溶出率減小有關。因此，后續(xù)實驗選擇乙醇的體積分數(shù)為80%、90%、100%進行優(yōu)化分析［13］。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Experimental factors and levels using RSM

圖1 乙醇體積分數(shù)對總酚提取量的影響Fig.1 Effect of volume fraction of ethanol on TPC

2.1.2 提取時間 在料液比固定為1∶20，加入90%的乙醇溶劑，溫度設定40℃，提取時間分別為20、40、60、80min時，研究堿蓬提取液中總酚的含量與時間的影響關系，結果見圖2。如圖2所示，當提取時間逐漸增加時，總酚的提取量隨時間的增加而增加，達到60min后，總酚的提取量達到最大值，60min后，總酚的提取量開始出現(xiàn)下降趨勢。這可能由于隨著時間的增加，堿蓬籽中總酚提取量增大到了實驗條件下的最大溶出值，而之后總酚的提取量顯示下降，可能是提取時間的增加也引起堿蓬細胞基質中其他組分的溶出增加，從而溶劑的粘度增加，溶質多酚的輸出速率受到阻礙而減小的緣故。因此選擇提取時間為40、60、80min 進行優(yōu)化。

2.1.3 提取溫度的選擇 以料液比1∶20加入90%的乙醇，提取時間設定60min，研究溫度分別為20、40、60、80、85℃時堿蓬中總酚提取量的影響，結果見圖3。當提取溫度到60℃時，總酚的提取量還在增加，到80℃時，提取量增加幅度逐漸減緩，甚至到85℃時，提取量開始有下降趨勢，原因可能與總酚物質在高于80℃后會破壞其結構而發(fā)生降解有關，所以實驗選擇40、60、80℃為后序優(yōu)化溫度。

圖2 時間對總酚提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on TPC

圖3 溫度對總酚提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on TPC

2.1.4 料液比 原料按料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40g/mL 時加入 90%乙醇，在 80℃ 條件下浸提60min，測定溶液中總酚的含量，結果如圖4。當料液比逐漸增加時，多酚的提取量逐漸增加，隨后隨著溶劑量的增加，總酚提取量又出現(xiàn)下降，這可能是因為溶劑量的增加，致使多酚與空氣的接觸機會增加，加速了多酚的氧化，所以提取量反而減小。從節(jié)約溶劑的角度考慮，選擇料液比為1∶20。

圖4 料液比對總酚提取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on TPC

2.2 提取工藝的響應面優(yōu)化分析

2.2.1 實驗結果及模型 依照表1中的設計進行實驗，響應值的實驗值見表2。

利用Design Expert軟件對表1實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到三次方的回歸模型為:

2.2.2 驗證結果 通過Design-Expert軟件，得出最優(yōu)提取條件為:乙醇體積分數(shù)為80%，時間為80min，溫度為80℃，料液比為23.42g/mL，理論最大提取率為996.94μg/g。驗證實驗把料液比修正為23g/mL，測定三次實驗的提取量分別為 997.62、989.81、970.66μg/g，平均值為 986.03μg/g，RSD%=1.41，這說明該方程與實際情況符合得較好，該軟件的優(yōu)化條件合理。

表2 響應面結果表Table 2 Results of response surface methodology

3 結論

測定堿蓬籽中總酚含量的測定實驗中的四個影響因素除外，超聲儀的功率也是主要因素之一。另外，文中得出的最優(yōu)工藝參數(shù)中，溫度80℃已經(jīng)達到了儀器設定溫度的上限，在優(yōu)化工藝條件下得到多酚量的預測值可能也不是最佳值。但實驗數(shù)據(jù)可以作為堿蓬多酚提取工藝的基本參考數(shù)據(jù)。目前對于天然植物中的總酚的提取方法應用廣泛的還有微波輔助提取法，都優(yōu)于傳統(tǒng)的熱回流法、索氏提取、浸取法等。另外提取溶劑的選擇應該朝向綠色化、環(huán)保型發(fā)展，離子液體是目前發(fā)展前景極好的選擇。對于這部分研究目前本工作室正在進行中。期望對于濕地、耐鹽、耐寒、及具有多種活性，且在食品、醫(yī)藥、工業(yè)應用廣泛的植物——堿蓬的研究提供可用的信息。

表3 回歸分析結果Table 3 Results of regression model and analysis of variance

［1］趙可夫，李法曾 .中國鹽生植物［M］.北京:科學出版社，1999.

［2］張學杰，樊守金，李法曾.中國堿蓬資源的開發(fā)利用研究狀況［J］.中國野生植物資源，2003，22(2):1-3.

［3］谷奉天.開發(fā)鹽地堿蓬綠色系列食品研究［J］.濱州教育學院學報，1999，5(3):43-48.

［4］周東生，王奇志，王鳴，等.鹽地堿蓬化學成分及其開發(fā)利用的研究進展［J］.中國野生植物資源，2011，30(1):6-9.

［5］吳詠梅，趙清，張云生，等 .特用植物——鹽地堿蓬［J］.新疆畜牧業(yè)，2001(3):22-23.

［6］孫宇梅，趙進，周威，等.我國鹽生植物堿蓬開發(fā)的現(xiàn)狀與前景［J］.北京工商大學學報:自然科學版，2005，23(5):1-4.

［7］黃曉昆，黃曉冬，卞美君.南方堿蓬葉黃酮類化合物含量及其體外抗氧化活性研究［J］.安徽農業(yè)科學，2010，38(3):1432-1434.

［8］衣丹，劉發(fā)義，臧家業(yè)，等.響應面法優(yōu)化堿蓬葉蛋白提取工藝研究［J］.食品工業(yè)，2011，(10):52-54.

［9］王昭晶.堿蓬水溶性多糖SPB的分離純化以及活性的初步研究［J］.食品科技，2010，35(9):236-238.

［10］高雪，王倩，李珂，等.高效液相色譜法優(yōu)化鹽地堿蓬甜菜紅素提取工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(3):259-261.

［11］羅倉學，史蘭，李振堯.菜籽粕總酚提取工藝優(yōu)化［J］.中國食品添加劑，2013(4):136-142.

［12］王新紅，吳秀紅，左玉香.紫茉莉種外皮總酚提取工藝響應面法優(yōu)化研究［J］.北方園藝，2013，286(7):147-150.

［13］陳海光，劉朝霞，于立梅.山竹果皮中總酚類物質的抗氧化性研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，9:107-115.