副溶血性弧菌噬菌體的分離及其在即食蝦中的應用

袁 琳，張昭寰，崔澤林，郭曉奎，趙 勇，*

(1.上海海洋大學食品學院，農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306;2.病原與微生物實驗室，上海交通大學醫(yī)學院，上海200025)

副溶血性弧菌是一種嗜鹽性革蘭氏陰性細菌，屬于弧菌科弧菌屬，易污染海產品和鹽腌食品，在港灣及沿海地區(qū)夏秋季的檢出量很高［1-2］。副溶血性弧菌是一種引起食源性疾病的重要病原菌，其致病性主要和致病基因耐熱直接溶血素TDH和相對耐熱直接溶血毒素TRH相關，可導致患者出現(xiàn)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)燒等典型胃腸炎反應［3］。國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，副溶血性弧菌引起的食物中毒、發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢，已經高居微生物性食物中毒首位［4］。

噬菌體作為細菌的天敵，在自然環(huán)境中廣泛存在，自然界中噬菌體的數(shù)量約為 1030～1031個［5］。噬菌體的結構簡單，主要由核酸和蛋白質外殼組成，具有嚴格的宿主專一性，只能感染某一類特定的菌種或菌株。根據(jù)與宿主菌作用方式的不同，噬菌體可分為溫和噬菌體和烈性噬菌體兩大類［6］。隨著超級細菌的出現(xiàn)，以及人們對食品安全的重視，采用噬菌體作為新型抑菌劑來生物防控細菌的增長成為研究的熱點［7-8］。由多種噬菌體組成的ListexTM P100，對肉制品、水產品及乳制品中的單增李斯特菌具有廣譜抗菌作用，能100%的殺滅被侵染的李斯特菌［9］。在噬菌體Sa9的作用下，3h內奶酪中的金黃色葡萄球菌可下降3.83log CFU/g［10］。利用噬菌體控制食品中沙門氏菌，大腸桿菌和空腸彎曲桿菌的生長亦有報導［7，11-12］。然而，關于副溶血性弧菌噬菌體分離的文章并不多見［13-15］，在即食蝦中應用的情況并未予以研究。本研究利用副溶血性弧菌作為宿主菌，從自然環(huán)境中分離噬菌體，測定理化性質，并通過實驗探究其在即食蝦中對副溶血性弧菌的抑菌作用，為噬菌體作為抑菌劑在食品中使用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

宿主菌由本實驗室從北京路橋技術有限責任公司購買保存的副溶血性弧菌 ATCC 33847，O3:K6，ATCC 33846以及114株實驗室所分離的食品源副溶血性弧菌菌株組成，其中攜帶毒力基因tdh的菌株共32株。分離噬菌體的樣品來自上海市銅川路水產品市場，上海東方國際水產品市場，東海，順翔路蝦養(yǎng)殖場。南美白對蝦，購自上海銅川路水產品市場。

TSB，TSA，TCBS培養(yǎng)基 北京陸橋技術有限責任公司;SM 緩沖液，50mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，1%gelation，pH7.2;TM 緩沖液，100mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L NaCl，10mmol/L MgCl2，1 ～10mmol/L CaCl2，pH7.2～7.5;PW 緩沖液，0.85%NaCl，1% 蛋白胨;PBS緩沖液，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L，pH7.2～7.4。培養(yǎng)液和緩沖液均經121℃，15min高壓滅菌后使用。

GHP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;MLS-3750型高壓滅菌鍋 三洋電機生物醫(yī)藥株式會社;SW-CJ-1FD系列超凈工作臺 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;HN-08型拍打式均質器 上海汗諾儀器公司;L-53R臺式大量冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;DH-1850臺式高速離心機 上海德洋意邦儀器有限公司;FRESC017微量臺式離心機 美國熱電離心機有限公司;Beckman Avanti J-26*P1高速離心機 美國Beckman有限公司;均質袋 北京陸橋技術有限公司。

1.2 菌種活化

各取-20℃保存的副溶血性弧菌菌種50μL，分別接種于5mL TSB(3%NaCl)培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)8～10h后，取50μL培養(yǎng)獲得的菌液轉接于5mL TSB(3%NaCl)培養(yǎng)基中，37℃下?lián)u床培養(yǎng)6～8h，兩次活化獲得菌懸液。

1.3 噬菌體的分離和純化

取不同地點的污水樣品，3800r/min離心20min，取上清液過0.22μm的微孔濾膜。將過濾液、3×TSB和混合菌株，50r/min 37℃培養(yǎng)過夜。取上清液，采用雙層平板法進行噬菌體分離，摳取透亮的噬菌斑于SM buffer，4℃低速混勻，三次純化。采用氯化鈉-聚乙二醇6000的方法純化并濃縮擴增的噬菌體，上清液保存于 4℃［16］。

1.4 噬菌體形態(tài)觀察

取擴增獲得的噬菌體液1mL，13000r/min，1h，棄上清，加入500μL 2%的GA溶液常溫固定30min，再13000r/min離心1h，保留沉淀，加入40μL無菌 PBS緩沖液重懸。采用乙酸雙氧鈾負染法觀察噬菌體形態(tài)。取純化的噬菌體液20μL滴于銅網(wǎng)上，靜置待其自然沉淀，用濾紙吸除多余液體，加1滴磷鎢酸染色1min，用濾紙吸除染液，電鏡觀察其形態(tài)。

1.5 熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性測定

將效價為7.2×1010pfu/m的噬菌體液分別與pH為 2、3、4、5、6、7、7.45、8、9、10、11 的 TM Buffer混合，在37℃水浴中作用1h后，雙層平板法確定噬菌體的pH穩(wěn)定性，重復3次。

將純化的噬菌體液分別置于 37、40、50、60、70℃水浴中作用20、40、60min。作用時間結束后立刻鋪雙層平板，確定效價。每個溫度和時間實驗重復3次。

1.6 噬菌體在即食蝦中的抑菌實驗

選取8株噬菌體SHOU24能感染的副溶血性弧菌作為宿主菌，于離心管中等量混勻，離心15min(3000r/min，25℃)，棄上清，用PW緩沖液重懸。最終菌液濃度為106CFU/mL。將菌液加入到100mL PW緩沖液中得到接種液 。蝦樣品在水中煮沸25min，煮沸后于生物安全柜內冷卻至室溫。將煮熟的南美白對蝦(～10g/只)浸泡于接種液中45min，按1∶100的比例置于噬菌體緩沖液中，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每次取3只蝦放入含有100mL PW緩沖液的均質袋，均質2min，采用PW緩沖液梯度稀釋，在TCBS培養(yǎng)基上涂布，37℃培養(yǎng)過夜。

應用英國食品研究所(IFR)Baranyi博士開發(fā)的DMFit v3.0軟件，用Baranyi生長模型對副溶血性弧菌的生長數(shù)據(jù)進行擬合［17］。根據(jù)擬合的生長曲線由DMFit軟件計算生長參數(shù)最大比生長速率(μmax)、遲滯期(lag)、以及最大菌數(shù)(D)。

公式(1)中，y和ymax分別是細菌的初始菌量和最大菌數(shù)(D);μmax為最大比生長速率;lag為遲滯期。

2 結果與分析

2.1 噬菌體的分離和純化

從銅川路水產品市場的污水樣本中分離得到一株裂解性的副溶血性弧菌噬菌體，命名為SHOU24。該噬菌體只能對19株含tdh的副溶血性弧菌有裂解作用，對其他非致病性副溶血性弧菌沒有產生裂解作用。噬菌體具有嚴格的宿主特異性，不能感染哺乳動物的細胞，僅能侵染特異的宿主菌，即一種噬菌體只能感染和裂解某種菌，甚至只能裂解種內的某些菌株［6］。噬菌體SHOU24裂解的宿主選擇性進一步說明了噬菌體嚴格的宿主特異性。非致病性的副溶血性弧菌對人體無害，SHOU24選擇性的感染與細菌和噬菌體間基因的橫向傳遞有關［6］，有利于控制致病性副溶血性弧菌的增殖。

SHOU24可形成透亮、清晰的噬菌斑，雙層平板培養(yǎng)6～8h后，噬菌斑的直徑約為0.8～1mm(圖1A)。

2.2 噬菌體的電鏡觀察

SHOU24頭部直徑約為70nm，尾長約為200nm。大部分噬菌體都屬于有尾噬菌體。有尾噬菌體又可分為肌尾噬菌體科，長尾噬菌體科和短尾噬菌體科［18］。根據(jù)噬菌體的形態(tài)特征分類，SHOU24屬于長尾噬菌體科(圖1-B)。長尾噬菌體的核酸多為雙鏈DNA，故推測噬菌體SHOU24的核酸為雙鏈DNA［19］。

圖1 副溶血性弧菌噬菌體SHOU24所形成的噬菌斑(1A)和電鏡觀察的形態(tài)(1B)Fig.1 Phage plaque(1A)and transmission electron micrograph(1B)of phage SHOU24

2.3 熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

在pH3～11的范圍內，SHOU24都能存活，其最適pH為7～8(圖2B)。SHOU24在4、25和37℃條件下，能穩(wěn)定存在。50℃處理1h后，仍有85%的存活率。在60℃條件下作用1h后，噬菌體幾乎失活(圖2A)。

2.4 即食蝦中的應用

采用平板計數(shù)法統(tǒng)計25℃條件下不同時間點即食蝦中副溶血性弧菌的菌數(shù)。通過DMFit v3.0軟件應用Baranyi生長模型擬合副溶血性弧菌的生長曲線(圖3)，并根據(jù)擬合的生長曲線計算副溶血性弧菌的生長參數(shù)(表1)。結果顯示，在噬菌體影響下，副溶血性弧菌的生長特性發(fā)生了明顯變化，生長的延滯期(lag)從0h(非處理組)增長至4.04h(噬菌體處理組)，最大菌數(shù)(D)減少了大約1 logCFU/g，但是對其生長速率的影響，利用SPSS19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，p＞0.05，無顯著性差異。

圖2 溫度(A)和pH(B)對噬菌體SHOU24的影響Fig.2 Thermal(A)and pH stability tests(B)of phage SHOU24

圖3 Baranyi模型擬合的25℃條件下即食蝦中副溶血性弧菌生長曲線Fig.3 Growth curves of V.parahaemolyticus on shrimp treated and untreated(Control)by bacteriophage stored at 25℃fitted by Baranyi model

3 結論

本研究從水產品市場的污水中分離得到只對含tdh致病性基因有裂解作用的烈性長尾噬菌體SHOU24。60℃作用1h后，噬菌體幾乎失活，與副溶血性弧菌噬菌體φpp2的情況類似［17］。在已報道的長尾副溶血性弧菌噬菌體中，SHOU24的尾部相對較長［15，20］。食品是富含營養(yǎng)的基質，有利于微生物的生存。在食品加工過程中，溫度和酸堿度有可能發(fā)生變化，噬菌體良好的耐熱能力和較廣的pH生存能力可增強噬菌體作為抗菌劑的能力［5］。噬菌體SHOU24對溫度和pH有較好的耐受性，為其應用于水產品中控制副溶血性弧菌提供了基礎。常溫條件下，噬菌體SHOU24能使副溶血性弧菌菌濃度下降1logCFU/g，可有效抑制即食蝦中副溶血性弧菌的生長。

表1 25℃條件下即食蝦中副溶血性弧菌生長參數(shù)Table 1 Growth kinetic parameters of V.parahaemolyticus on shrimp treated and untreated(Control)by bacteriophage stored at 25℃fitted by Baranyi model

噬菌體是一種能侵染宿主菌并在宿主菌體內增殖的細菌病毒，具有嚴格的宿主特異性，且具有增殖速度快、自然界中廣泛存在等特點。作為有效、安全的生物控制制劑，利用噬菌體控制食品中單增李斯特菌［9］、沙門氏菌［21］、大腸桿菌［22］、金黃色葡萄球［7］菌等致病性菌的文獻已有報導，但噬菌體裂解酶在溶菌作用方面只成功地應用于革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌暫未見報導［23］。目前噬菌體作為生物抑菌劑的研究方向主要包括三個角度的應用，即多種噬菌體協(xié)同作用、噬菌體裂解酶的應用及噬菌體和天然抗菌劑的結合。噬菌體SHOU24亦可和其他噬菌體或天然抗菌劑結合，從而擴大在水產品中的應用范圍或增強作用效果。

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