大腸桿菌抗氧化基因突變對內(nèi)源過氧化氫的影響

李 欣，楊麗鵬，杜 琳，喬家駒，尤曉顏，劉云宏，張 敏，張玉先，王利平

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471023)

H2O2是國標(biāo)允許在食品中應(yīng)用的食品漂白劑和抗菌劑，主要應(yīng)用于小麥粉、食用油、蛋白等［1］。同時，H2O2在食品中也廣泛存在，如在水果的成熟、衰老和果皮褐變作用過程中，H2O2扮演重要角色［2］。特別是在農(nóng)產(chǎn)品儲藏過程中，H2O2對其儲藏品質(zhì)有著重要影響，直接涉及到食品的自身酸敗和褐變問題程度［3-7］。那么如何控制食品H2O2水平便成為一急需解決的問題。本實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，H2O2與很多相關(guān)酶作用有關(guān)，我們可以通過加強(qiáng)對H2O2的了解，進(jìn)而嘗試尋找控制H2O2產(chǎn)生機(jī)制的更為有效的手段，為食品品質(zhì)保證提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

H2O2是活性氧的一種，是細(xì)胞有氧代謝的產(chǎn)物［8-9］。H2O2作為機(jī)體對外界脅迫反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，它可選擇性的誘導(dǎo)許多相關(guān)基因的表達(dá)，以提高其自身的免疫能力［10］。但是，H2O2含量過多機(jī)體出現(xiàn)生理功能失衡、代謝紊亂等中毒癥狀，機(jī)體就會遭受極大威脅［11-12］?；钚匝蹩焖?、短暫的積累的意義在于引發(fā)局部壞死，構(gòu)建自身的防御體系［13-16］。因此，細(xì)胞內(nèi)源H2O2的調(diào)控及其機(jī)制的研究具有重要的意義。

大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)胞內(nèi)通過生物膜電子傳遞鏈以及多種氧化還原酶系調(diào)控H2O2等活性氧的釋放［17］。已有研究證明OxyR可以識別細(xì)胞內(nèi)高水平的H2O2，是細(xì)菌抗氧化代謝系統(tǒng)主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白［18］;烷基過氧化物酶基因ahpC/F的轉(zhuǎn)錄受到OxyR的正調(diào)控［19-20］;單功能的過氧化氫酶KatE和超氧化物歧化酶SodS作為重要的抗氧化酶在排毒方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［21-22］。因此，為了闡明離體條件下抗氧化基因 ahpC/F、katE/G、oxyR ahpC/F、sodA/B在降解H2O2方面的作用，揭示E.coli抗氧化系統(tǒng)的作用機(jī)制，本研究選用E.coli抗氧化基因的突變體菌株為實(shí)驗(yàn)材料，能夠?yàn)槠渌?xì)菌內(nèi)源H2O2的調(diào)控機(jī)制提供指導(dǎo)性的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株

E.coli雙基因(ahpC/F)缺失突變體菌株JI370、雙基因(katE/G)缺失突變體菌株 JI367、三基因(oxyRahpC/F)缺失突變體菌株LC74、雙基因(sodA/B)缺失突變體菌株AS240以及野生型菌株MG1655美國伊利諾伊大學(xué)微生物系James A.Imlay教授饋贈。將凍干保存的上述菌株取干粉接種到無菌水中混勻，靜置30min后取20μL移接到LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至菌液混濁，用終濃度為30%的甘油保存菌種，備用［22］。

LB液體培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L。

1.2 主要試劑和儀器

30%(V/V)的H2O2、磷酸鉀、辣根過氧化物酶、溴酚紅 洛陽市奧科化玻儀器公司;氯化鈰 Sigma公司，UK;透射電子顯微鏡 TEM100C，JEOL，Tokyo;Hitachi F-4500熒光分光光度計(jì) 深圳市昊光機(jī)電科技應(yīng)用有限公司;UV-2800AH紫外分光光度計(jì) 杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 E.coli抗氧化基因突變株過氧化氫酶活性測定 用紫外分光光度法測定酶活。有氧條件下，大腸桿菌生長到至少四代，取對數(shù)期的菌懸液稀釋至109CFU·mL-1，然后接種于固定體積的液體培養(yǎng)基中，保證初始菌株生長狀態(tài)一致，取不同生長時間的菌懸液離心收集菌體，用室溫50mmol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)重懸菌體沉淀，用上述緩沖液洗兩次，重懸至菌體至420nm處OD值為0.1。在磷酸鹽緩沖體系中外加H2O2至終濃度為2mmol/L，一定時間間隔(30s)檢測A240變化，每分鐘A240降低值為過氧化氫酶活性［23］。

1.3.2 E.coli抗氧化基因突變株內(nèi)源H2O2水平檢測 采用熒光法:按照Seaver和Imlay的［15］方法進(jìn)行H2O2濃度定量測定。實(shí)驗(yàn)中取對數(shù)期的菌懸液稀釋至109CFU·mL-1，然后接種于固定體積的液體培養(yǎng)基中，特定時間取同等量的菌液測H2O2釋放量。

1.3.3 過氧化氫的電鏡組織化學(xué)法定位(氯化鈰-CeCl3法) 采用組織化學(xué)的方法對E.coli的內(nèi)源H2O2積累進(jìn)行檢測［24］。37℃培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集菌體，用含5mol/L氯化鈰(CeCl3)的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸并在37℃下預(yù)處理溫育1.5h。細(xì)胞中的H2O2積累可以被CeCl3(Sigma，UK)特異染色，并且按照Bestwick等［25］的方法通過檢測鈰過氧化物的沉積物判斷過氧化氫的積累位點(diǎn)。過氧化氫特異染色后離心收集菌體，棄去含殘余CeCl3的上清液，3%戊二醛重懸細(xì)胞4h以上，離心沉淀菌體。經(jīng)OsO4后固定、環(huán)氧樹脂包埋后切片，用透射電子顯微鏡在80kV電壓下觀察(TEM100C，JEOL，Tokyo)。處理對照細(xì)胞時，不加入CeCl3對細(xì)胞中的過氧化氫染色，后續(xù)處理與染色細(xì)胞相同。對鈰過氧化物沉積密度設(shè)定了4個等級:0，無特定部位的沉積;1，微弱并不連續(xù)的沉積;2，從不連續(xù)到連續(xù)的清晰沉積;3，大量的沉積。

1.3.4 E.coli抗氧化基因突變株生長曲線繪制 參照文獻(xiàn)［26-27］的方法，測定細(xì)菌培養(yǎng)液的光吸收值(OD420)，分析細(xì)菌的離體生長動態(tài)。實(shí)驗(yàn)中取對數(shù)期的菌懸液稀釋至109CFU·mL-1，然后接種于固定體積的液體培養(yǎng)基中，保證初始菌株生長狀態(tài)一致。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。獨(dú)立樣本間的差異顯著性分析用Nonparametric Tests，包括 Mann-Whitney Test、Moses Test、Two-Sample Kolmogorov-Smirnov Test和Wald-Wolfowitz Test。不同基因突變造成的差異顯著性用pairedsample T test分析。結(jié)果分為顯著(p＜0.05)和極顯著(p＜0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化基因突變對過氧化氫酶活性的影響

為了明確抗氧化基因突變對過氧化氫酶活性的影響，檢測了大腸桿菌不同突變體菌株8～40h過氧化氫酶活性的變化。結(jié)果顯示，所有菌株過氧化氫酶活性隨著接種時間的延長不斷升高。突變株LC74的過氧化氫酶活性一直低于野生型;8h時，突變株AS240過氧化氫酶活性低于野生型，8h之后，過氧化氫酶活性高于野生型;8h及之后，突變株JI367和JI370的過氧化氫酶活性高于野生型;16h之后，各菌株過氧化氫酶活性呈現(xiàn)一個規(guī)律性的變化，即JI367＞AS240＞JI370＞MG1655＞LC74。

圖1 大腸桿菌突變體菌株的酶活曲線Fig.1 The enzyme activity change cures of E.coli strains JI370，JI367，LC74，AS240 and MG1655

內(nèi)源H2O2變化曲線顯示，在細(xì)菌的整個生長周期中內(nèi)源H2O2的濃度隨著生長時間的延長不斷增加，抗氧化基因katE/G、ahpC/F、sodA/B分別缺失的突變株 JI367、AS240、JI370，其內(nèi)源 H2O2水平均低于野生型，而抗氧化基因oxyRahpC/F缺失的突變株LC74在生長到20h以后內(nèi)源H2O2水平顯著高于野生型(p＜0.05)。不同的抗氧化基因突變株內(nèi)源H2O2水平相差較大，突變株LC74內(nèi)源H2O2產(chǎn)生水平最高，可達(dá)到30μmol/L，與野生型相比差異極顯著(p＜0.01)，突變株JI370次之，JI367和AS240突變株內(nèi)源H2O2水平濃度最高時可達(dá)到15μmol/L，與野生型相比差異顯著(p＜0.05)。

圖2 大腸桿菌突變體菌株H2O2產(chǎn)生曲線Fig.2 Hydrogen peroxide production curves of E.coli strains JI370，JI367，LC74 and AS240

2.2 組織化學(xué)染色法定位細(xì)菌內(nèi)源H2O2

透射電子顯微鏡下觀察結(jié)果顯示5個被檢菌株的H2O2水平有顯著差異。圖3結(jié)果顯示:MG1655細(xì)胞經(jīng)過染色后H2O2主要積累在細(xì)胞壁上且連續(xù)清晰(等級2)，質(zhì)膜和胞質(zhì)等其它位點(diǎn)沒有檢測到H2O2的積累;突變株LC74內(nèi)源H2O2在細(xì)胞壁上大量積累，細(xì)胞質(zhì)上也能明顯的觀察到H2O2的積累，水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它菌株(等級3);JI370可清晰觀察到細(xì)胞壁上連續(xù)的H2O2積累(等級2);AS240中可觀察到H2O2在細(xì)胞壁上微弱不連續(xù)的沉積(等級1);JI367內(nèi)源H2O2積累較少，不能明顯的觀察到(等級0)。

2.3 抗氧化基因突變對E.coli生長的影響

圖3 大腸桿菌內(nèi)源過氧化氫的沉積Fig.3 Endogenous hydrogen peroxide accumulation in wild type and mutant strains of E.coli

E.coli抗氧化基因突變對細(xì)菌生長的影響如圖4所示，通過圖表可以看出，E.coli突變株的生長曲線與野生型相比差異較大。突變株LC74與野生型一樣有較明顯的遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，但是突變體在對數(shù)期后期菌量高于野生型，可以推斷出此時胞內(nèi)H2O2的濃度(約5.4μmol/L)就是促進(jìn)細(xì)菌生長的臨界最低濃度，而當(dāng)其到達(dá)穩(wěn)定期時菌體量大約是野生型的1.2倍，說明突變株的生長速度受到促進(jìn)或者裂解速度比野生型慢;其它三種突變株則都沒有明顯的穩(wěn)定期，對數(shù)期過后直接進(jìn)入衰亡期，說明這些突變株在衰亡期的裂解速度非?？?，JI367生長周期最短，其次是AS240，再次是JI370。

圖4 大腸桿菌突變體的生長曲線Fig.4 The growth curves of E.coli strains JI370，JI367，LC74，AS240 and MG1655

3 結(jié)論與討論

烷基過氧化物還原酶(alkylhydroperoxide reductase，Ahp)、過氧化氫酶(CAT)以及超氧化物歧化酶(SOD)是細(xì)胞內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中的重要酶類，胞內(nèi)的H2O2水平由上述三種酶相互協(xié)調(diào)作用，共同調(diào)控［28］。結(jié)果顯示，與野生型相比，大腸桿菌突變株JI367、JI370和AS240的過氧化氫酶活性升高，內(nèi)源H2O2的濃度降低;而突變株LC74過氧化氫酶活性降低，內(nèi)源H2O2的濃度升高(圖1和圖2)。推測ahpC/F、katE/G基因突變后直接影響到Ahp和CAT酶的活性，內(nèi)源H2O2的濃度本應(yīng)下降，但是在OxyR調(diào)控子的作用下，其他酶活性補(bǔ)償性的升高，因此造成內(nèi)源H2O2的濃度降低;而當(dāng)oxyR基因突變時，直接導(dǎo)致下游的CAT活性降低，H2O2濃度降低;sod基因突變導(dǎo)致SOD酶不能正常歧化超氧陰離子，對應(yīng)產(chǎn)生的H2O2含量就會降低。Imlay教授等研究者的結(jié)論也與此相符［28-29］。由此可說明OxyR作為一個全局性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶之間的補(bǔ)償性表達(dá)中起到了至關(guān)重要的作用。不同細(xì)菌中不同抗氧化酶的作用是不同的，在E.coli中抗氧化酶Kat、Ahp和Sod在降解內(nèi)源H2O2能力方面所起的作用不同，Ahp起主要作用，Sod次之，Kat最小。

正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)H2O2的濃度維持在一定范圍內(nèi)，并且隨著生長時間的延長H2O2的濃度也會不斷的增加(圖2)。熒光法及組織化學(xué)染色法均檢測到內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生(圖2和圖3)，無論透射電子顯微鏡的觀察結(jié)果還是熒光法的定量檢測結(jié)果均顯示，H2O2在細(xì)胞中普遍存在，不同菌株內(nèi)源H2O2的水平有所差別。E.coli細(xì)胞中H2O2的積累主要定位在細(xì)胞壁，當(dāng)胞內(nèi)H2O2量足夠多時也會在細(xì)胞質(zhì)中積累(圖3)。

E.coli抗氧化基因 katE/G、ahpC/F、sodA/B可能與延滯期氧化物質(zhì)的降解有關(guān)，它們?nèi)笔Ш笫辜?xì)菌總量在延滯期下降，從而導(dǎo)致后期細(xì)菌的生長緩慢;而抗氧化基因oxyRahpC/F缺失使細(xì)菌總量在指數(shù)生長期后期升高，從而促進(jìn)了后期細(xì)菌的生長(圖4)，當(dāng)oxyRahpC/F三突變株LC74中內(nèi)源H2O2的濃度大于約5.4μmol/L時能促進(jìn)細(xì)菌生長(圖4和圖2)。可見，細(xì)胞內(nèi)適量H2O2的積累對于細(xì)菌生長是有積極作用的。本實(shí)驗(yàn)探討OxyR與其調(diào)控的katE/G、ahpC/F、sodA/B基因之間的協(xié)同作用，為深入研究細(xì)菌內(nèi)源H2O2的代謝及其調(diào)控機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步闡明動植物細(xì)胞中活性氧代謝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

［1］范華鋒，張忠義，劉振林.分光光度法測定食品中過氧化氫［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16(9):1079-1080.

［2］張福平，劉燕菁.火龍果過氧化氫酶活性的研究［J］.食品工業(yè)科技，2008，(11):128-129.

［3］黃永洪，花慧，沈國強(qiáng)，等.豬肝過氧化氫酶提取條件的研究［J］.生物加工過程，2004，2(4):61-63.

［4］張燁，王克建，郝艷賓，等.影響核桃貯藏品質(zhì)因素的分析［J］.保鮮與加工，2005，5(3):4-5.

［5］王靜，徐為民，諸永志，等.貯藏溫度對鮮切牛蒡褐變的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24(4):492-496.

［6］周顯青，張玉榮，等.稻谷儲藏中細(xì)胞膜透性，膜脂過氧化及體內(nèi)抗氧化酶活性變化［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2009，23(2):159-162.

［7］張玉榮，周顯青，張勇.儲存玉米膜脂過氧化與生理指標(biāo)的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41(10):3410-3414.

［8］龐新躍，李欣，王娜，等.植物病原黃單胞菌毒性相關(guān)基因?qū)?nèi)源過氧化氫的上游調(diào)控作用研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2011，41(4):379-384.

［9］李欣，李鑫玲，龐新躍，等.水稻白葉枯病菌內(nèi)源過氧化氫在細(xì)胞分裂周期中的時空定位變化［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45(8):1499-1504.

［10］周建波，吳茂森，胡俊，等.H2O2對水稻白葉枯病菌過氧化氫酶相關(guān)基因 crg表達(dá)的誘導(dǎo)作用［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2009，39(4):399-404.

［11］Barth C，Moeder W，Klessig D F，et al.The timing of senescence and response to pathogens is altered in the ascorbatedeficient Arabidopsis mutant vitamin c-l［J］.Plant Physiol，2004，134(4):1784-1792.

［12］Turpaev K T.Reactive oxygen species and regulation of gene expression［J］.Biochemistry-US，2002，67(3):281-292.

［13］Huycke M M，Moore D，Joyce W，et al.Extracellular superoxide production by Enterococcus faecalis requires demethylmenaquinone and is attenuated by functional terminal quinol oxidases［J］.Mol Microbiol，2001，42(3):729-740.

［14］Yankovskaya V，Horsefield R，T?rnroth S，et al.Architecture of succinate dehydrogenase and reactive oxygen species generation［J］.Science(New York，N.Y.)，2003，299(5607):700-704.

［15］Seaver L C，Imlay J A.Are respiratory enzymes the primary sources of intracellular hydrogen peroxide?［J］.J Biol Chem，2004，279(47):48742-48750.

［16］Thannickal V J，F(xiàn)anburg B L.Reactive oxygen species in cell signaling［J］.Am J Physiol-Lung C，2000，279(6):1005-1028.

［17］李耀文，柳參奎.水稻CAT與逆境應(yīng)答關(guān)系及酶活性分析［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28(3):509-514.

［18］張建堂，高潔，吳茂森，等.轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OxyRxoo對水稻白葉枯病菌 H2O2降解途徑的調(diào)控作用［J］.微生物學(xué)報(bào)，2009，49(7):874-879.

［19］王艷麗，吳茂森，田芳，等.水稻白葉枯病菌ahpC基因的轉(zhuǎn)錄單元分析和原核表達(dá)［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2012，12:115-119.

［20］Panmanee W，Hassett D J.Differential roles of OxyR-controlled antioxidant enzymes alkyl hydroperoxide reductase(AhpCF)and catalase(KatB)in the protection of Pseudomonas aeruginosa against hydrogen peroxide in biofilm vs.planktonic culture［J］.Fems Microbiol Lett，2009，295(2):238-244.

［21］Guo M，Block A，Bryan C D，et al.Pseudomonas syringae catalases are collectively required for plant pathogenesis［J］.J Bacteriol，2012，194(18):5054-5064.

［22］Heo Y J，Chung I Y，Cho W J，et al.The major catalase gene(katA)of Pseudomonas aeruginosa PA14 is under both positive and negative control of the global transactivator OxyR in response to hydrogen peroxide［J］.J Bacteriol，2010，192(2):381-390.

［23］王華芳，展海軍.過氧化氫酶活性測定方法的研究進(jìn)展［J］.科技咨詢導(dǎo)報(bào)，2009，19:7-8.

［24］Able A J，Guest D I，Sutherland M W.Hydrogen peroxide yields during the incompatible interaction of tobacco suspension cells inoculated with Phytophthora nicotianae［J］.Plant Physiol，2000，124(2):899-910.

［25］Bestwick C S，Brown I R，Bennett M H，et al.Localization of hydrogen peroxide accumulation during the hypersensitive reaction of lettuce cells to Pseudomonas syringae pv.Phaseolicola［J］.Plant Cell，1997，9(2):209-221.

［26］齊放軍，高世強(qiáng)，吳茂森，等.一氧化氮和過氧化氫誘導(dǎo)水稻細(xì)胞過敏反應(yīng)的協(xié)同作用分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39(1):61-65.

［27］Gnanamanickam S S，Brindha P V，Narayanan N N，et al.An overview of bacterial blight disease of rice and strategies for its management［J］.Curr Sci India，1999，77:1435-1443.

［28］Lauren C S，James A I.Alkyl Hydroperoxide Reductase Is the Primary Scavenger of Endogenous Hydrogen Peroxide in Escherichia coli［J］.J Bacteriol，2001，183(24):7173-7181.

［29］Lauren C S，James A I.Hydrogen peroxide fluxes and compartmentalization inside growing Escherichia coli［J］.J Bacteriol，2001，183(24):7182-7189.