影響米粉干轉(zhuǎn)基因成分熒光PCR檢測(cè)的若干因素分析

江樹勛，張 冰，邵碧英，繆婷玉，彭 娟，陳文炳，*

(1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350001;2.福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州 350003;3.廈門塔斯曼生物工程公司，福建廈門 361023)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的產(chǎn)生使動(dòng)植物、微生物等生物體性狀改良成為可能［1］，包括生長性能、抗病、抗逆性、營養(yǎng)品質(zhì)［2］等。在中國，稻米產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)量的40%，是過半中國人的主糧［3］，從1988年首個(gè)可育的轉(zhuǎn)基因水稻植株培育成功［4］，基因工程技術(shù)在我國水稻品種改良上得到了廣泛的研究。目前已經(jīng)培育成功的轉(zhuǎn)基因水稻植株所攜帶的目的基因主要包括抗蟲、抗病、抗逆、抗除草劑和改善營養(yǎng)品質(zhì)等類型［5］。鑒于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性還未定性，世界各國仍將轉(zhuǎn)基因食品安全列為重點(diǎn)問題［6］。許多國家相繼制定了轉(zhuǎn)基因生物的管理法規(guī)，要求對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)［7］。挪威［8］是首個(gè)實(shí)行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品含量標(biāo)識(shí)的國家，標(biāo)識(shí)低限為2%:歐盟的標(biāo)識(shí)低限［9］為1%。我國［10］于2001年5月23日頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，2002年3月20日開始貫徹實(shí)行《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》。

表1 熒光定量PCR引物/探針序列Table 1 The primer/probe sequence of fluorescence PCR

表2 引物、探針用量不同的3個(gè)PCR反應(yīng)體系Table 2 Three PCR reaction systems of different dosage of primers and probe

目前轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的對(duì)象已經(jīng)從一般農(nóng)產(chǎn)品擴(kuò)展到深加工產(chǎn)品，如食用油脂、米制品、醬油、飼料等［11］，我國出口的米制品一直是歐盟等國家或地區(qū)檢測(cè)的重點(diǎn)［12］，對(duì)我國出口米制品影響很大。歐盟在2008年4月15日起對(duì)中國大米及其制品要求實(shí)施檢測(cè)并出具統(tǒng)一的衛(wèi)生證書才能出口［13］。但在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中，通常情況下提取DNA時(shí)僅要求把原料研磨成粉，一般不對(duì)顆粒細(xì)度提具體要求，這種情況下的主要顆粒細(xì)度為50～100目，同時(shí)存在大量小于50目和小量大于100目的顆粒，對(duì)溫育時(shí)間要求一般是1h(如大豆)或以上(如大米等)，由于這些條件往往無法穩(wěn)定滿足對(duì)深加工產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的準(zhǔn)確性。為此，本文針對(duì)影響深加工米制品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR［14-16］結(jié)果準(zhǔn)確性的各種因素進(jìn)行研究，建立了規(guī)范的技術(shù)操作程序，為保障我國進(jìn)出口米制品安全提供了科學(xué)檢測(cè)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

非轉(zhuǎn)基因大米與米制品米粉干(線狀)為企業(yè)送檢留樣，科豐6號(hào)轉(zhuǎn)基因大米樣品(含CaMV35S、Nos、Cry1Ab、Ub-c外源基因成分)由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。CTAB十六烷基三甲基溴化銨;TE緩沖液、蛋白酶K與RNA分解酶等購自上海生工生物工程有限公司;Premix Ex Taq(2×)(Probe qPCR)試劑盒購自大連寶生物科技公司。大米內(nèi)源基因(GOS)與外源基因［17］(CaMV35S、NOS、Cry1Ab、Ub-c)擴(kuò)增用的引物與探針由大連寶生物科技公司合成(表1)。

高速冷凍離心機(jī) 日立公司;臺(tái)式離心機(jī) 德國Eppendorf公司;核酸蛋白分析儀 德國Amersham公司;PCR超凈工作臺(tái) 美國Labconco公司;ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模擬轉(zhuǎn)基因米粉干樣品配制及DNA提取 按照四分法對(duì)每個(gè)非轉(zhuǎn)基因米粉干樣品分樣，稱取200g烘干研磨成細(xì)粉，分別制成＜50目、50～100目、＞100目3個(gè)細(xì)度范圍的樣品。相同方式制備科豐6號(hào)轉(zhuǎn)基因大米樣品，兩者按照相同細(xì)度和相應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別配制轉(zhuǎn)基因大米含量為1%、0.1%、0.01%、0.001%4個(gè)轉(zhuǎn)基因含量梯度的模擬轉(zhuǎn)基因米粉干樣品，比如同等粒度的99.99g非轉(zhuǎn)基因米粉干粉末與0.01g轉(zhuǎn)基因大米粉末充分混勻，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%(m/m)的模擬轉(zhuǎn)基因米粉干。

采用 CTAB 法［18］提取 DNA。

1.2.2 熒光PCR反應(yīng)體系與條件 設(shè)熒光PCR單管反應(yīng)體積為20μL，引物與探針用量如表2。

實(shí)時(shí)熒光 PCR反應(yīng)主程序?yàn)?95℃，10min;95℃，35s，60℃，60s，45 個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)2 次。設(shè)置陰性對(duì)照、空白對(duì)照和陽性對(duì)照。閾值設(shè)定原則［19］根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整。

1.2.3 熒光PCR檢測(cè) 對(duì)不同含量和細(xì)度的108個(gè)樣本分別提取2份DNA，每個(gè)DNA做2個(gè)熒光PCR反應(yīng)，即每個(gè)樣本做4個(gè)PCR重復(fù)，共檢測(cè)5個(gè)基因:大米內(nèi)源基因(GOS)與外源基因 CaMV35S、NOS、Cry1Ab、Ub-c(Kefeng 6)，總共進(jìn)行 2160 管PCR反應(yīng)，每次(96孔板)實(shí)驗(yàn)都設(shè)置陽性對(duì)照、非轉(zhuǎn)基因大米陰性對(duì)照與雙蒸水(ddH2O)空白對(duì)照［20］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)不同處理?xiàng)l件下樣品DNA質(zhì)量濃度與內(nèi)源和外源基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果(Ct值)的差異顯著性進(jìn)行方差分析，并估算邊際均值圖。

1.4 檢出率實(shí)驗(yàn)

因檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域通常認(rèn)為熒光PCR轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)限［21］為0.01%(轉(zhuǎn)基因含量0.01%樣品，檢出率達(dá)到95%以上)，本實(shí)驗(yàn)擬在探究以上實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)樣品前處理方法的基礎(chǔ)上，探究了進(jìn)一步提高熒光PCR轉(zhuǎn)基因成分的檢出率，即選用轉(zhuǎn)基因含量為0.001%的米粉干樣品，實(shí)驗(yàn)其檢出陽性樣品的百分率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品顆粒細(xì)度及溫育時(shí)間對(duì)DNA提取效果影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了＜50目、50～10目、＞100目3個(gè)研磨顆粒細(xì)度和1、4、8h 3種CTAB溫育時(shí)間，表3為含量為0.01%的樣品提取的DNA濃度情況。

表3 米粉干樣品提取的DNA濃度(ng/μL)Table 3 The DNA concentration of rice noodle samples(ng/μL)

表3是米粉干樣品提取的9種處理組合下2個(gè)重復(fù)提取的DNA濃度平均數(shù)據(jù)，各個(gè)樣品的DNA質(zhì)量經(jīng)核酸蛋白分析儀測(cè)試，結(jié)果可知，DNA的OD260/OD280值都在1.7～2.0范圍內(nèi)，符合 PCR 檢測(cè)要求［22］。但是在相同的顆粒細(xì)度下，提取到的DNA濃度隨著溫育時(shí)間的增長而增高，溫育時(shí)間達(dá)到8h條件下效果最好;在溫育時(shí)間相同情況下，DNA濃度隨樣品顆粒細(xì)度的增加而增高，顆粒大小為＞100目的樣品提取到的DNA濃度最高。方差分析結(jié)果表明，樣品顆粒細(xì)度與CTAB緩沖液溫育時(shí)間對(duì)樣品DNA提取濃度的影響均達(dá)到極顯著水準(zhǔn)(F行=73.00，F(xiàn)列=65.53，F(xiàn)0.01=18.00，p ＜0.01)。

2.2 熒光PCR反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.1 引物、探針用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響實(shí)驗(yàn)樣品DNA為0.01%轉(zhuǎn)基因大米含量的米粉干樣品在研磨細(xì)度50～100目，CTAB緩沖液溫育時(shí)間達(dá)到8h條件下提取的DNA，測(cè)定3種引物、探針用量體系下內(nèi)源基因和外源基因?qū)崟r(shí)熒光PCR的Ct值，每個(gè)基因做4個(gè)重復(fù)。結(jié)果如表4。

表4結(jié)果顯示，PCR反應(yīng)體系2測(cè)得的Ct值均比體系1和體系3的Ct值小，效果最好。

2.2.2 DNA模板濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響 采用2.2.1中的DNA原液及2倍和6倍稀釋液進(jìn)行體系2實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了3個(gè)DNA濃度梯度樣品的內(nèi)源基因 GOS和外源基因 CaMV35S、NOS、Cry1Ab熒光PCR的Ct值。結(jié)果如表5。

表4 不同引物、探針用量下4個(gè)基因熒光PCR檢測(cè)結(jié)果(Ct值)Table 4 Fluorescence PCR detection results(Ct value)of 4 genes under different dosage of the primers and probe

表5 不同DNA濃度下4種基因熒光PCR檢測(cè)結(jié)果(Ct值)Table 5 Fluorescence PCR detection results(Ct value)of four genes under different concentration of DNA

從表5可以看出，DNA用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的Ct值影響明顯。DNA用原液時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果的Ct值最小，效果最理想。即DNA濃度較高時(shí)，Ct值相對(duì)較小，有利于提高熒光PCR檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。

2.3 不同含量梯度樣品對(duì)檢出結(jié)果的影響

對(duì)不同轉(zhuǎn)基因含量的米粉干樣品進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，結(jié)果Ct值整理后利用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析F檢驗(yàn)，分析目數(shù)和溫育時(shí)間兩種因素間及兩種因素的交互作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的顯著性。同時(shí)利用Microsoft Office Excel 2003軟件對(duì)Ct值進(jìn)行邊際均值估算，分析最優(yōu)處理組合。

由表6對(duì)4種轉(zhuǎn)基因含量大米樣品F檢驗(yàn)結(jié)果表明，目數(shù)因素對(duì)0.001%含量的 CaMV35S、1%和0.1%含量的GOS影響不顯著，0.001%含量的NOS影響較顯著，其它均有極顯著影響;時(shí)間因素對(duì)1%含量的CaMV35S、0.01%含量的NOS和0.001%含量的Cry1Ab的影響較顯著，其它均有極顯著影響;兩因素間交互作用對(duì)1%、0.1%含量的GOS無顯著影響，僅對(duì)0.01%、0.001%含量情況下的GOS有極顯著影響，對(duì)1%和0.1%的CaMV35S、NOS、Cry1Ab以及0.1%的Ub-c有極顯著影響。

表6 米粉干樣品F檢驗(yàn)Table 6 F test of dry rice noodle samples

以0.01%轉(zhuǎn)基因含量米粉干樣品為例，其4個(gè)外源基因檢測(cè)結(jié)果的估算邊際均值圖如圖1～圖4所示:

圖1 0.01%轉(zhuǎn)基因含量米粉干CaMV35S估算邊際均值Fig.1 Estimating marginal average figure of CaMV35S of 0.01%GM rice noodles

圖2 0.01%轉(zhuǎn)基因含量米粉干NOS估算邊際均值Fig.2 Estimating marginal average figure of NOS of 0.01%GM rice noodles

圖3 0.01%轉(zhuǎn)基因含量米粉干Cry1Ab估算邊際均值Fig.3 Estimating marginal average figure of Cry1Ab of 0.01%GM rice noodles

可見，對(duì)于4個(gè)外源基因Ct值最小時(shí)對(duì)應(yīng)的樣品前處理?xiàng)l件都是樣品顆粒細(xì)度＞100目和溫育時(shí)間8h，其他不同轉(zhuǎn)基因含量米粉干樣品Ct值的估算邊際均值圖與此結(jié)論基本一致(圖略)，由此可確定米粉干樣品前處理的最佳組合是樣品顆粒細(xì)度＞100目和溫育時(shí)間8h。

圖4 0.01%轉(zhuǎn)基因含量米粉干Ub-c估算邊際均值Fig.4 Estimating marginal average figure of Ub-c of 0.01%GM rice noodles

2.4 檢出率實(shí)驗(yàn)

以轉(zhuǎn)基因含量為0.001%的米粉干樣品進(jìn)行檢出率實(shí)驗(yàn)，測(cè)定外源基因CaMV35S、NOS、Cry1Ab的Ct值，結(jié)果如表7所示:

表7 轉(zhuǎn)基因含量0.001%的米粉干樣品檢出結(jié)果Table 7 Detection results of rice noodle samples with 0.001%content of genetically modified rice

表7表明，恰當(dāng)?shù)那疤幚泶胧┛梢允沟脵z出限(以檢出率大于95%為指標(biāo))降低到轉(zhuǎn)基因含量0.001%，且PCR檢測(cè)的Ct值平均數(shù)(n=48)都在陽性結(jié)果判斷值(36)以下(表8)。

表8 經(jīng)最優(yōu)前處理后的米粉干模擬樣品轉(zhuǎn)基因成分Ct平均值Table 8 Average Ct values of transgenic components in simulated rice noodle samples after the optimum pre-treatment

3 結(jié)論

本文以模擬轉(zhuǎn)基因深加工米粉干為研究材料，探討了熒光PCR反應(yīng)體系、樣品顆粒大小和DNA提取中樣品在CTAB緩沖液中的溫育時(shí)間對(duì)樣品DNA提取效果和熒光PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。

方差分析F檢驗(yàn)結(jié)果表明，樣品顆粒細(xì)度與CTAB緩沖液浸泡溫育時(shí)間對(duì)DNA濃度產(chǎn)生的影響均達(dá)到極顯著水準(zhǔn)，顆粒細(xì)度＞100目、CTAB緩沖液溫育時(shí)間達(dá)到8h的樣品提取的DNA濃度最高;不同處理?xiàng)l件下的大米內(nèi)源基因GOS與4個(gè)外源基因的Ct值存在顯著或極顯著影響，不管哪個(gè)基因，從估算邊際均值圖可以看出樣品細(xì)度與CTAB溫育時(shí)間的最佳組合是樣品顆粒細(xì)度＞100目與CTAB緩沖液溫育時(shí)間8h。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的檢出率實(shí)驗(yàn)說明，前處理對(duì)檢出率有顯著影響，恰當(dāng)?shù)那疤幚泶胧┛梢允沟脵z出限(以檢出率大于95%為指標(biāo))降低到轉(zhuǎn)基因含量0.001%，是熒光PCR通常認(rèn)為的檢出限0.01%的10倍，且PCR檢測(cè)的Ct值平均數(shù)(n=48)都在陽性結(jié)果判斷值(36)以下［參考轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2584-2010］。說明恰當(dāng)?shù)臉悠非疤幚泶胧┘由蟽?yōu)化的熒光PCR反應(yīng)體系條件可使不同轉(zhuǎn)基因含量樣品檢出效果更為理想，并能在一定程度上降低檢測(cè)限，這將對(duì)檢測(cè)相關(guān)產(chǎn)品的深加工轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)具有重要參考意義，實(shí)踐證明應(yīng)用該條件在對(duì)本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)米粉干等深加工產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分中起到較好的效果。

［1］蔣家煥，郭奕明，楊映根，等.轉(zhuǎn)基因水稻的研究和應(yīng)用［J］.植物學(xué)報(bào)，2003，20(6):736-744.

［2］姚方印，朱常香，李廣賢，等.Bt水稻的抗蟲性鑒定及轉(zhuǎn)基因的遺傳分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002 ，35(2):142-145.

［3］姬華，樂國偉，王洪新，等.轉(zhuǎn)基因食品的營養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2009，36(7):73-74.

［4］Hernandez M，Esteve T，PlaM.Real-time polymerase Chain reaction based assays for quantitative detection of badey，rice，snnflower，and wheat［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53(18):7003-7009.

［5］Lemt S，England LS，Vincet M，et al.Real-time polymerase chain reaction qualification of the transgenes for roundup ready corn and ready soybean in soil samples［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53(5):1337-1342.

［6］王國英.轉(zhuǎn)基因植物的安全性評(píng)價(jià)［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001(9):205-207.

［7］Nickson TE.Editor's choice aeries onthe next generation of biotech crops:planning environmentalrisk assessmentfor genetically modified crops:problem formulation forstress，toleranterops［J］.Plant Physiology，2008，147:494-502.

［8］Kaeppler HF.Food safety assessment of genetically modified crops［J］.AgronomyJournal，2000，92:793-797.

［9］Joanne E，Barton MD.Genetically modified crops and the environment［J］.AgronomyJournal，2000，92:797-803.

［10］吳志毅，張明哲，陳曦.大米和米制品Bt63轉(zhuǎn)基因檢測(cè)PCR方法的靈敏度研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21(6):549-554.

［11］鄧鴻鈴，郭新東，吳玉鑾.利用 PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)BT基因水［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，23(4):71-74.

［12］譚慧，王洋，潘峰，等.植物源性轉(zhuǎn)基因食品PCR檢測(cè)技術(shù)研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫雜志，2004，14(4):407-409.

［13］李文濤，王俊東，楊利峰，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通訊，2006，17(1):112-114.

［14］陳文炳，王志明，李壽崧，等.分子標(biāo)記在動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫與GMO產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，33(4):494-500.

［15］陳穎，徐寶梁，蘇寧，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)中的應(yīng)用研究［J］.作物學(xué)報(bào)，2004，30(6):602-607.

［16］吳孝橫，路勇.利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因大米［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25(2):211-216.

［17］農(nóng)業(yè)部953號(hào)公告-6-2007，轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因水稻定性PCR方法［S］.

［18］Made D，Degner C，Grohmann L.Detection of genetically modified rice:a construct-speciffic real-time PCR method based on DNA sequence from transgenic Bt rice［J］.Eur Food Res Techol.，2006，224:217-278.

［19］蔣春燕，王泰健，王琴，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26(12):97-101.

［20］Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Mainiatis T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.金東雁，黎孟楓譯 .北京:科學(xué)出版社，1989，690-692.

［21］馮仁蜂.分析靈敏度(檢測(cè)限)［J］.上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2002，17(3)，133-136.

［22］李金明.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2007，120-123.