真菌Aspergillus hennebergii酸性蛋白酶小麥固態(tài)發(fā)酵性能研究

黃永光，徐 巖

(1.教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀酒科學(xué)與酶技術(shù)中心，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心創(chuàng)新團(tuán)隊，江蘇無錫214122;2.釀酒科技雜志社，貴州貴陽550007)

中國傳統(tǒng)白酒釀造固態(tài)發(fā)酵與其他發(fā)酵方式不一樣，屬于多菌種的多維自發(fā)調(diào)控共酵的多邊發(fā)酵方式［1］。整個發(fā)酵過程，主要是通過微生態(tài)變化與釀造底物物態(tài)變化之間的共同調(diào)節(jié)，推進(jìn)固態(tài)發(fā)酵和實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)［2］。傳統(tǒng)名優(yōu)白酒釀造固態(tài)發(fā)酵原料一般為谷物原料，特別是制曲原料所用的小麥含有較高的蛋白質(zhì)，在釀造過程必須通過外加條件進(jìn)行催化降解，如添加生物酶，改變發(fā)酵環(huán)境的酸度、溫度等發(fā)酵條件參數(shù)來促進(jìn)蛋白質(zhì)的水降，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成小肽、氨基酸等小分子參與生物代謝、促進(jìn)微生物生長、增加酒體風(fēng)味等［3］。

在固態(tài)發(fā)酵釀造過程主導(dǎo)性酶為淀粉酶、糖化酶、蛋白酶。其過程酸性蛋白酶的應(yīng)用可實(shí)現(xiàn)多維協(xié)同性的調(diào)控作用，如溶解發(fā)酵原料顆粒促進(jìn)糖化發(fā)酵;分解蛋白質(zhì)原料為微生物繁殖提供營養(yǎng)型小肽、氨基氮，供給微生物生長所需的營養(yǎng)源;積累氨基酸可促進(jìn)氨基酸代謝，豐富、改善酒體中的風(fēng)味物質(zhì);提高乙醇濃度等。因此，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酸性蛋白酶功能菌及其分泌酸性蛋白酶在固態(tài)發(fā)酵過程發(fā)揮了巨大的功能作用，愈來愈受到研究者和行業(yè)的重視［3］。目前，固態(tài)發(fā)酵法釀造白酒過程產(chǎn)酸性蛋白酶的微生物主要為霉菌，主要菌株有黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、泡盛酒曲霉(Aspergillusawamori)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、根霉(Rhizopus spp)等以及變異株、突變株［4］。商品型酸性蛋白酶生產(chǎn)菌主要為黑曲霉和宇佐美曲霉菌株。在曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶方面研究也比較多，如Fei等人［5］對黑曲霉變異菌株6042酸性蛋白酶的性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

Aspergillus hennebergii是從醬香型白酒釀造過程分離獲得的真菌［3］。目前，有關(guān)A.hennebergii酸性蛋白酶及其在固態(tài)發(fā)酵過程的研究尚未見相關(guān)報道。本文以小麥為原料，主要研究A.hennebergii產(chǎn)酸性蛋白酶對小麥固態(tài)發(fā)酵性能的影響，包括:添加酸性蛋白酶對釀酒酵母生物量的影響;對原料蛋白的水解情況;對發(fā)酵醅氨基酸態(tài)氮含量變化的影響;對乙醇濃度的影響等。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥:采集于貴州茅臺鎮(zhèn)原產(chǎn)地小麥，水分11.47%，淀粉 64.32%，支鏈淀粉 54.8%，蛋白質(zhì) 13.55%［6］。

菌株:A.hennebergii［3］、Saccharomyces cerevisiae［6］，均分離于醬香型白酒釀造過程。

酸性蛋白酶:絲狀真菌A.hennebergii產(chǎn)酸性蛋白酶，實(shí)驗(yàn)室分離純化獲得，酶活為120U/mL。

3，5-二硝基水楊酸、三氯乙酸、酪素、福林酚等試劑，均為分析純，購于中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

PB2002-N稱量天平 瑞士Mettler-Toledo公司;高壓蒸汽SS325全自動滅菌鍋 日本Tomy公司;無菌超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備廠;生化恒溫培養(yǎng)箱HX-9080B-2 上海福碼實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;高速冷凍離心機(jī)Avanti J-E 美國Beckman Coulter公司;酶標(biāo)儀 美國Thermo公司;氨基酸分析液相色譜儀 美國安捷倫公司;Waters 600型高效液相色譜儀 美國Waters公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 新鮮干燥小麥，粉碎成小麥粉，取過80目篩比例為60%的混合麥粉。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵條件 準(zhǔn)確稱取50g粉碎原料于500mL三角瓶中，加蒸餾水調(diào)水分達(dá)到48%，拌勻，121℃、0.1MPa滅菌 20min。冷卻至 30～35℃，接入2.0mL S.cerevisiae菌懸液(1.0×107spores/mL)。同時，按20U/g發(fā)酵醅加入A.hennebergii酸性蛋白酶。拌勻后置于30℃恒溫培養(yǎng)1～7d。發(fā)酵過程每隔24h取樣測定相關(guān)指標(biāo)。以不加酸性蛋白酶作為空白對照樣。每個樣做三個重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 分析方法 生物量測定:采取活菌平板計數(shù)法。

乙醇濃度測定:參考文獻(xiàn)［7］。

游離氨基酸測定:采用色譜法［8］。

還原糖測定:采用 DNS 法［9］。

總酸測定:參考Li等人的方法［10］?？偹岱治鲇?.1mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以乳酸計。

水解度(DH)分析:取發(fā)酵4d的發(fā)酵醅進(jìn)行水解度分析，水解度的測定采用pH-stat法［11］，水解產(chǎn)物分子量分析參考Liu等人的方法［12］。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 15.0進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及Ducan多重檢驗(yàn)(p＜0.05)，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)示。

2 結(jié)果與討論

2.1 S.cerevisiae生物量變化

真菌酸性蛋白酶在發(fā)酵過程對S.cerevisiae的變化具有正向調(diào)控作用［6，13］，特別是對蛋白酶分泌缺陷型S.cerevisiae菌株的純種發(fā)酵或高濃度發(fā)酵，外加蛋白酶對緩解營養(yǎng)缺陷限制和發(fā)酵環(huán)境脅迫條件約束、縮短延遲期、提高S.cerevisiae生物量、延緩酵母衰退、延續(xù)發(fā)酵都具有很重要的意義。圖1為本實(shí)驗(yàn)中S.cerevisiae小麥固態(tài)發(fā)酵過程添加A.hennebergii酸性蛋白酶對其生物量的影響結(jié)果。

圖1 酸性蛋白酶對發(fā)酵醅中酵母生物量的影響Fig.1 Effect of acid protease on the yeast biomass of fermented grains

從圖1可看出，發(fā)酵過程S.cerevisiae的變化趨勢呈現(xiàn)先快速增加，后緩慢遞增到平緩，最后逐漸降低的趨勢。與空白對照比較，添加生物酸性蛋白酶能明顯加速細(xì)胞生長，促進(jìn)S.cerevisiae的繁殖，使細(xì)胞生物量較快的達(dá)到峰值，細(xì)胞生長速率增加，同時在生物量達(dá)到峰值期后能延緩細(xì)胞衰退，延長S.cerevisiae發(fā)酵期。由此可見，A.hennebergii酸性蛋白酶的添加可以實(shí)現(xiàn)S.cerevisiae發(fā)酵的正向調(diào)控，發(fā)酵過程S.cerevisiae生物量提高達(dá)37.09%。

S.cerevisiae在發(fā)酵過程的主要功能是代謝積累乙醇和酯化生香提供風(fēng)味成分，其前提都需要提供氮源及能量，確保S.cerevisiae的活性和生物量的增加，特別是在不外加營養(yǎng)源的固態(tài)發(fā)酵過程，其生長過程所需氮源的獲取及其攝入尤其顯得困難，必須通過參與發(fā)酵的微生物自身分泌蛋白酶對其發(fā)酵底物進(jìn)行水解來提供營養(yǎng)型氮源。正如本固態(tài)發(fā)酵過程S.cerevisiae的明顯增長主要靠添加A.hennebergii酸性蛋白酶促進(jìn)小麥蛋白水解不斷提供氨基氮源。這與 Kolothe 等人［14］的研究結(jié)果一致;Atisom 等人［15］的研究也取得了同樣的效果。細(xì)胞延遲期的縮短主要原因在于處于不利發(fā)酵環(huán)境條件下的細(xì)胞能很快從環(huán)境中攝取氨基酸，增加細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度，從而增加細(xì)胞活性和對不利環(huán)境脅迫因子的耐受性。發(fā)酵過程，氨基酸的攝入也一定程度改變了細(xì)胞內(nèi)與氨基酸代謝和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)聯(lián)蛋白表達(dá)量的上調(diào)，蛋白表達(dá)量的增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白合成速率加快［16］，使其更有利于細(xì)胞在延遲期的活性恢復(fù)和生長，實(shí)現(xiàn)生物量的增加。

2.2 乙醇濃度的變化

發(fā)酵的最終目標(biāo)之一是提高發(fā)酵醅乙醇濃度，因此發(fā)酵醅乙醇濃度也是衡量發(fā)酵是否正常和高效的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究過程通過分析比較對照樣和添加生物酸性蛋白酶對發(fā)酵醅乙醇濃度的影響，來考察A.hennebergii酸性蛋白酶對S.cerevisiae小麥固態(tài)發(fā)酵質(zhì)量的影響，其結(jié)果見圖2。

圖2 酸性蛋白酶對發(fā)酵醅乙醇含量的影響Fig.2 Effect of acid protease on the ethanol content of fermented grains

圖2結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，在24h后發(fā)酵醅的乙醇濃度呈快速的增加，到60h后增速放緩?？傮w結(jié)果表明，添加酸性蛋白酶有利于S.cerevisiae代謝乙醇的積累，提高發(fā)酵醅乙醇濃度達(dá)38.29%。該結(jié)果與A.hennebergii酸性蛋白酶自身的性質(zhì)有關(guān)，如pH特性、酶活性質(zhì)與環(huán)境脅迫條件的適應(yīng)性、蛋白酶結(jié)構(gòu)等［3］;這些都是影響發(fā)酵過程S.cerevisiae代謝乙醇的關(guān)鍵因素。從圖2還可以看出，在72h后發(fā)酵醅酒精濃度不再大幅度增加，基本穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)，到第5d后趨于逐漸降低，主要原因可能在于發(fā)酵初期時發(fā)酵醅中含有一定量的氧氣，同時添加酸性蛋白酶水解蛋白質(zhì)為S.cerevisiae的生長提供氮源，促進(jìn)S.cerevisiae的快速繁殖，為增加發(fā)酵強(qiáng)度提供了前提，致使發(fā)酵醅的乙醇濃度得以提高。隨著發(fā)酵醅中氧氣的耗盡，S.cerevisiae厭氧發(fā)酵實(shí)現(xiàn)乙醇的積累，發(fā)酵醅乙醇濃度迅速提高對S.cerevisiae和酶形成產(chǎn)物抑制，發(fā)酵醅中的酸性蛋白酶和其他酶系的酶活性降低，導(dǎo)致發(fā)酵逐步衰退［17-18］，乙醇積累降低。還有部分乙醇也參與了酯類等物質(zhì)的合成，一定程度上也有所降低。此時，發(fā)酵后期的發(fā)酵強(qiáng)度和發(fā)酵質(zhì)量取決于乙醇的積累速度，S.cerevisiae的乙醇耐受性、酸性蛋白酶的乙醇耐受性，如后者的作用強(qiáng)度大于前者，發(fā)酵繼續(xù)趨向乙醇積累的方向，如弱于后者發(fā)酵逐漸偏離正常狀態(tài)，發(fā)酵質(zhì)量隨發(fā)酵時間的延長而降低，氮源供給效率逐漸弱化，發(fā)酵醅中酵母活性降低，逐漸衰老或死亡，故乙醇量基本不再增加。

發(fā)酵過程乙醇的代謝積累與細(xì)胞的生物量有關(guān)。在本研究過程發(fā)酵醅生物量的增加為厭氧發(fā)酵積累代謝乙醇起到基礎(chǔ)性的作用。同時，添加酸性蛋白酶增加氨基酸，促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度的增加，引起參與乙醇代謝途徑相關(guān)的蛋白表達(dá)量的上調(diào)，特別是乙醇脫氫酶Adh1p和Adh4p的高表達(dá)，還有Act1p蛋白表達(dá)的上調(diào)也給予了極大的貢獻(xiàn)［19-21］，導(dǎo)致乙醇的不斷積累。

2.3 氨基酸態(tài)氮含量變化

在S.cerevisiae固態(tài)發(fā)酵過程，氮源是主要的營養(yǎng)物質(zhì)和氨基酸代謝產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的調(diào)控因子。其來源主要有兩方面，一是釀造原料中的蛋白在蛋白酶的作用下最終水解為氨基酸，這類氮源在外加蛋白酶后或菌株生長過程隨分泌蛋白酶的產(chǎn)生就開始積累和發(fā)揮功能作用;二是來源于發(fā)酵過程S.cerevisiae死亡后其菌體蛋白的蛋白酶水解產(chǎn)物氨基酸不斷進(jìn)入發(fā)酵醅中，這類氮源的增加主要發(fā)生在菌體生長的衰亡期后。因此，要實(shí)現(xiàn)發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)效益化，整個發(fā)酵過程從S.cerevisiae的生物量而言在其生長延遲期、對數(shù)期和穩(wěn)定期提供氮源最為重要。在延遲期提供氮源，可以恢復(fù)細(xì)胞活性，促進(jìn)S.cerevisiae生長，縮短延遲期，但從發(fā)酵產(chǎn)率、發(fā)酵質(zhì)量來講，則對整個發(fā)酵過程進(jìn)行有序的控制、調(diào)節(jié)更為重要，因?yàn)閭鹘y(tǒng)白酒釀造固態(tài)發(fā)酵期比較長，產(chǎn)率要求較高，風(fēng)味質(zhì)量要求較高，因此必須對整個過程進(jìn)行協(xié)調(diào)性的調(diào)控，而且是多邊調(diào)控，包括生物量、酶活、乙醇濃度、風(fēng)味成分種類及其含量等等，這樣才能提高發(fā)酵質(zhì)量和生產(chǎn)率，發(fā)揮酶的最大功效。添加生物酸性蛋白酶對發(fā)酵醅氨基酸的影響結(jié)果見圖3。

圖3 酸性蛋白酶對發(fā)酵醅氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of acidic protease on the amino nitrogen content of fermented grains

由圖3可知，發(fā)酵醅氨基酸態(tài)氮含量的變化與添加酸性蛋白酶密切相關(guān)。發(fā)酵醅氨基酸態(tài)氮呈緩慢增加，但含量不高可能是由于發(fā)酵醅中酸性蛋白酶活性不夠或添加量不夠使得氨基酸態(tài)氮增加緩慢，最終氨基酸態(tài)氮含量提高為34.21%。小麥中含有13%左右的蛋白，發(fā)酵過程蛋白不斷被A.hennebergii酸性蛋白酶水解，生成小肽和氨基酸被酵母利用，進(jìn)入細(xì)胞和參與生化代謝途徑;另一方面蛋白酶水解可破壞原料顆粒間質(zhì)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)［22］，更利于發(fā)酵過程酶的作用，提高發(fā)酵質(zhì)量。蛋白酶的性質(zhì)不同對小麥蛋白水解效果也存在明顯差異。研究表明，堿性蛋白酶酶解小麥蛋白后氨基酸的總量變化較小(總量提高8.03%);而酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物中氨基酸總量提高達(dá)到21.09%，酸性蛋白酶水解可明顯提高小麥蛋白的溶解度［17］。對小麥蛋白水解物的研究結(jié)果還表明，堿性蛋白酶酶解前后呈顯著差異的氨基酸為蛋氨酸，胱氨酸、色氨酸;酸性蛋白酶酶解前后呈顯著差異的氨基酸為酪氨酸，胱氨酸、色氨酸、賴氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、蘇氨酸和丙氨酸［23］，酸性蛋白酶水解產(chǎn)物多為風(fēng)味型及風(fēng)味代謝型氨基酸。

2.4 還原糖的變化

小麥含豐富的淀粉，可用于制曲、釀酒、制醋、制醬等，為參與發(fā)酵的微生物生長提供碳源和為可發(fā)酵型糖的轉(zhuǎn)化提供底物。釀造過程發(fā)酵正常與否、發(fā)酵效率高低不但可以通過發(fā)酵醅乙醇濃度來衡量，而且還可以直接體現(xiàn)在還原糖等指標(biāo)的變化上。由于小麥淀粉較易水解為還原糖，還原糖被S.cerevisiae利用的速率取決于酵母的生物量，S.cerevisiae的生物量一定程度上也決定于發(fā)酵醅中的氨基酸的濃度和種類。因此，發(fā)酵過程還原糖消耗速率快，最終殘?zhí)蔷偷?，乙醇濃度則高，都是高質(zhì)量發(fā)酵的期望。添加A.hennebergii酸性蛋白酶對固態(tài)發(fā)酵醅還原糖變化影響的結(jié)果見圖4。

圖4 酸性蛋白酶對發(fā)酵醅還原糖含量的影響Fig.4 Effect of acid protease on the reducing sugar content of fermented grains

在本研究過程，還原糖的變化主要決定于添加的真菌酸性蛋白酶和S.cerevisiae分泌酶的共同作用。圖4結(jié)果表明，生物酸性蛋白酶的添加，導(dǎo)致發(fā)酵醅的還原糖變化較明顯。在前期酵母主要處于生長過程，對還原糖利用較低，通過酶作用淀粉并積累還原糖，使其含量快速增加。隨著酵母進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵，還原糖被S.cerevisiae利用轉(zhuǎn)化為乙醇，含量逐漸降低。最后因營養(yǎng)限制、S.cerevisiae衰老和產(chǎn)物抑制，S.cerevisiae生物量降低，淀粉轉(zhuǎn)化的糖分基本不再被利用，從而基本得到穩(wěn)定。但也可以看出，在添加酸性蛋白酶后，可加速淀粉向還原糖的轉(zhuǎn)化，繼續(xù)為S.cerevisiae發(fā)酵提供前體，有利于發(fā)酵度的提高。

2.5 總酸的變化

發(fā)酵過程，原料降解、S.cerevisiae代謝、酶解等方式均可以將淀粉等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，如乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸等，改變發(fā)酵體系的酸性環(huán)境。圖5為添加酸性蛋白酶對小麥S.cerevisiae發(fā)酵過程發(fā)酵醅酸度變化的影響結(jié)果。

圖5 酸性蛋白酶對發(fā)酵醅酸度的影響Fig.5 Effect of acid protease on the acidity of fermented grains

如圖5所示，從24h開始，發(fā)酵醅總酸含量逐漸上升，到96h左右發(fā)酵達(dá)到頂點(diǎn)，隨后逐漸下降，最后趨于基本穩(wěn)定。添加酸性蛋白酶的發(fā)酵醅總酸變化結(jié)果明顯高于對照發(fā)酵醅，這可能是因?yàn)樘砑铀嵝缘鞍酌复龠M(jìn)了小麥蛋白最終水解產(chǎn)物氨基酸的積累和由于相應(yīng)生物量的增加及其代謝強(qiáng)度增加對發(fā)酵醅中呈酸物質(zhì)的貢獻(xiàn)，致使發(fā)酵醅酸度增加，最終發(fā)酵醅總酸提高達(dá)36.17%。發(fā)酵后期，總酸的下降，與發(fā)酵過程產(chǎn)生的有機(jī)酸及參與微生物代謝和其他生化反應(yīng)有關(guān)，比如與醇生成酯，形成香味成分等。

2.6 蛋白水解度變化

小麥蛋白主要為麥谷蛋白和麥醇溶蛋白，在中性條件下，溶解性極小，在越偏離中性時，溶解性較好［22-24］。在發(fā)酵過程，其水解度直接影響到為S.cerevisiae提供營養(yǎng)和生長因子的程度，水解度越高，蛋白最終水解產(chǎn)物氨基酸量越高，越對S.cerevisiae生長有利。圖6為發(fā)酵不同時期小麥蛋白水解度的分析結(jié)果;表1為添加酸性蛋白酶對發(fā)酵96h后小麥蛋白水解產(chǎn)物分子量的影響結(jié)果。

圖6 酸性蛋白酶對發(fā)酵醅蛋白水解度的影響Fig.6 Effect of acid protease on the hydrolysis degree of fermented grains protein

高水解度有利于提高水解產(chǎn)物中的小分子肽和氨基酸的含量。如圖6所示，24h后，小麥蛋白開始快速水解，隨著發(fā)酵時間的推移，水解度逐漸增加，到72h后才趨于平衡。與對照樣比較，添加酸性蛋白酶能明顯促進(jìn)小麥蛋白的水解，這也與S.cerevisiae生物量、乙醇產(chǎn)量、氨基酸態(tài)氮含量變化結(jié)果趨勢一致。圖2結(jié)果表明，72h后乙醇積累達(dá)到峰值，雖然酶活會受到乙醇的產(chǎn)物抑制影響，可能會影響蛋白水解能力衰減，但乙醇的積累同樣為醇溶蛋白的水解提供了條件，增加醇溶蛋白的溶解性，因此水解仍然繼續(xù)進(jìn)行，特別是前期水解產(chǎn)物小分子蛋白或小肽段繼續(xù)進(jìn)一步水解產(chǎn)生氨基酸。因此，圖6中水解度仍然呈現(xiàn)增加態(tài)勢。最后，隨發(fā)酵時間的延長，酶逐漸被消耗，活性降低，與酶作用的肽鍵逐漸減少，水解反應(yīng)趨于停滯。另外，酶的產(chǎn)物抑制也隨發(fā)酵時間的延長更加明顯。

表1 發(fā)酵96h后發(fā)酵醅蛋白水解產(chǎn)物的分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of fermented grains protein hydrolyzate

發(fā)酵過程小麥蛋白水解產(chǎn)物(表1)結(jié)果表明，三種發(fā)酵條件的蛋白水解效果存在明顯差異，水解效果最好的還是添加生物酸性蛋白酶的發(fā)酵醅。圖6結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，小麥蛋白水解度不斷增加，大分子蛋白逐漸被水解成小肽(表1)。而且水解產(chǎn)物主要集中在小分子量區(qū)間，而且300u以下的小肽占有較高的比例，說明添加A.hennebergii酸性蛋白酶能將小麥蛋白水解成小分子小肽，并進(jìn)一步被水解成氨基酸，提供發(fā)酵微生物利用和促進(jìn)生物代謝，提高發(fā)酵體系的質(zhì)量?？傮w來看，添加酸性蛋白酶可使小麥固態(tài)發(fā)酵中蛋白水解度提高28.26%，300u以下小麥蛋白水解產(chǎn)物提高達(dá)14.1%。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)固態(tài)法白酒釀造過程及發(fā)酵環(huán)境極其復(fù)雜，涉及多菌系、多酶系、多物系、多變性的多維多邊發(fā)酵系統(tǒng)，存在著產(chǎn)酒與生香的矛盾，釀造發(fā)酵過程既要創(chuàng)造條件促進(jìn)微生物的生長繁殖，實(shí)現(xiàn)自然調(diào)控與演替，又要限制發(fā)酵條件保障發(fā)酵進(jìn)程正常產(chǎn)酒與生香。因此，在發(fā)酵過程必須要滿足和實(shí)現(xiàn)各多維系統(tǒng)之間的協(xié)同性，才能實(shí)現(xiàn)發(fā)酵正?；透弋a(chǎn)多效，不然會導(dǎo)致發(fā)酵異常。在整個酸性發(fā)酵環(huán)境下，酸性蛋白酶對發(fā)酵體系中的蛋白水解、微生物生長和風(fēng)味成分的形成與調(diào)控起著舉足輕重的作用，既要實(shí)現(xiàn)對發(fā)酵底物蛋白進(jìn)行水解，提供小肽、氨基酸等，為微生物生長提供氮源，保障發(fā)酵過程的生物學(xué)動力;同時氨基酸等參與細(xì)胞生化反應(yīng)，進(jìn)行氨基酸代謝，促進(jìn)酒體風(fēng)味成分的形成;酸性蛋白酶又要接受發(fā)酵積累的產(chǎn)物抑制和環(huán)境脅迫條件抑制。本研究結(jié)果表明，添加生物酸性蛋白酶除了強(qiáng)化小麥蛋白水解，為S.cerevisiae生長提供氨基酸等營養(yǎng)外，還能促進(jìn)生物量的增加;氨基酸在酶和S.cerevisiae的作用下進(jìn)一步生成醇、酯、酚等物質(zhì);同時氨基酸的增加，可促進(jìn)芳香族氨基酸代謝，產(chǎn)生更多的風(fēng)味成分，賦予白酒特有的香氣［3］。如可促進(jìn)甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等代謝，產(chǎn)生更多的酸、醛、酮、酯、吡嗪類等風(fēng)味物質(zhì);生物酸性蛋白酶的添加可以進(jìn)一步改善發(fā)酵質(zhì)量;提高乙醇產(chǎn)率。

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