麻瘋樹籽殼乙醇提取物的抗氧化活性研究

馬 博，張婷婷，劉細(xì)祥，李榮峰，農(nóng)定確

(百色學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西百色533000)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻瘋樹籽 購買于廣西南寧富民達(dá)生物科技有限公司。麻瘋樹籽去雜除塵后脫仁，籽殼置于電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)50℃干燥72h，粉碎、過60目篩，石油醚索氏回流脫脂12h、揮干石油醚，將其4℃保藏、備用。

1，1-二苯基-2-苦基肼(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH)和 2，4，6- 三 吡 啶基-S-三嗪(ferric-tripyridyltiazine，TPTZ)Sigma公司;2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(Butylated hydroxytoluene，BHT)(GC，＞99.0%) 阿拉丁公司;蘆丁國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鄰苯三酚、三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、抗壞血酸(VC)、無水對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇、石油醚(30～60℃)及檸檬酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2700紫外可見分光光度計(jì) 日本島津;FA2004電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;TGL-16M高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;DHG-9146A型鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;LD-200中藥粉碎機(jī) 長沙常宏制藥機(jī)械設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麻瘋樹籽殼乙醇提取物制備 取麻瘋樹籽殼粉，按照料液比1∶25，溶于70%(V/V)的乙醇溶液中，85℃回流提取2.5h，抽濾，濾液減壓除去乙醇，定容。

1.3.2 麻瘋樹籽殼乙醇提取物中總黃酮含量測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［5］。分別精密量取0.2mg/mL蘆丁溶液(30%乙醇制)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置入 25mL 容量瓶中，各加1.0mL 5%的NaNO2溶液，混勻后靜置6min;再各加1.0mL 10%的Al(NO3)3溶液，混勻，靜置6min;最后各加10mL 4%的NaOH溶液，混勻，30%乙醇溶液定容，靜置15min。以空白試劑為對(duì)照，在510nm處測定各自吸光度，再以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、以蘆丁的不同質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為Y1=10.993x-0.0005，R2=0.9998，線性范圍為8～40μg/L。取1.0mL麻瘋樹籽殼乙醇提取液，置入25mL容量瓶中，按照上述方法進(jìn)行測定總黃酮提取液的吸光度，并代入回歸方程，求出麻瘋樹籽殼乙醇提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度。代入公式(1)計(jì)算麻瘋樹籽殼乙醇提取物中總黃酮的含量。

式中，R為總黃酮含量(%);c為提取液中黃酮濃度(mg/mL);v為黃酮提取液體積(mL);n為稀釋倍數(shù);m為麻瘋樹籽殼質(zhì)量(g)。

1.3.4 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn) DPPH·是一種較為穩(wěn)定的以氮為中心的芳香族自由基，其醇溶液呈紫色，在517nm處有特征峰?？寡趸瘎┩ㄟ^傳遞電子或氫原子來中和DPPH·，使其在517nm下吸光度下降，進(jìn)而評(píng)價(jià)供試物抗氧化能力。按照參考文獻(xiàn)［7］，稍作修改。6.5mmol/L的DPPH溶液(無水乙醇配制)4.0mL，加無水乙醇1.0mL，混勻、反應(yīng)40min后，于517nm測吸光度，記錄為A0;用不同黃酮質(zhì)量濃度的麻瘋樹籽殼乙醇提取液代替1.0mL無水乙醇，其余步驟同上，于517nm測吸光度，記錄為 A1;用4.0mL無水乙醇代替DPPH溶液，并用不同黃酮質(zhì)量濃度的麻瘋樹籽殼乙醇提取液代替無水乙醇，混勻、反應(yīng) 40min后，于 517nm測吸光度，記錄為 A2。DPPH·清除率 η3(%)=［1-(A1-A2)/A0］×100。

1.3.6 還原力的測定實(shí)驗(yàn) 采用普魯士藍(lán)法。按照參考文獻(xiàn)［6］，稍作修改。取2.5mL不同黃酮質(zhì)量濃度的麻瘋樹籽殼乙醇提取液，加入0.2mol/L的PBS(pH6.6)2.5mL，混勻，再加入 1%(m/V)的 K3Fe(CN)62.5mL，混勻，50℃水浴20min后，再加入10%(V/V)三氯乙酸 2.5mL，混勻，3000r/min離心10min，取上清液5mL加入0.1%的FeCl3溶液1mL，后用蒸餾水補(bǔ)至10mL，混勻并靜止10min，在700nm處測吸光值。

1.3.7 總抗氧化能力實(shí)驗(yàn) 采用鐵離子還原/抗氧化能力分析法(Ferric reducing/antioxidant Power，F(xiàn)RAP)法［10］。先用 0.04mol/L 的 HCl溶液配制0.01mol/L的TPTZ溶液，然后與0.3mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH3.6)、0.02mol/L 的 FeCl3溶液按照 10∶1∶1的體積比混合得到TPTZ工作溶液。再分別取不同黃酮質(zhì)量濃度的麻瘋樹籽殼乙醇提取液0.1mL，加入1.8mL預(yù)熱至37℃的FRAP工作液，用蒸餾水補(bǔ)至5mL，混勻，37℃下反應(yīng)20min，于593nm處測定其吸光度，并在FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得FRAP值(以mmol/L的Fe2+表示)。用不同摩爾濃度FeSO4溶液代替麻瘋樹籽殼乙醇提取液，其余操作同上，以吸光度為縱坐標(biāo)，以不同摩爾濃度FeSO4為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并借助Excel 2003進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻瘋樹籽殼乙醇提取物中總黃酮的測定

麻瘋樹籽殼乙醇提取物中總黃酮含量為6.61%。

2.2 超氧陰離子清除作用

圖2 麻瘋樹籽殼乙醇提取物對(duì)超氧陰離子的清除作用Fig.2 Scavenging activity of ethanol extracts from Jatropha curcus L.seed shell on superoxide anion radicals

2.2 DPPH自由基清除作用

由于DPPH·實(shí)驗(yàn)敏感性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、操作簡單、短時(shí)內(nèi)能做多個(gè)樣品，目前已被廣泛用于評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化性能［10-11］。由圖3所示。在質(zhì)量濃度0.05～0.3mg/mL范圍內(nèi)，麻瘋樹籽殼乙醇提取物和BHT對(duì)DPPH·清除率都隨質(zhì)量濃度的增大而增加，而后二者清除率均不再顯著增加。另外，從質(zhì)量濃度0.2mg/mL起，麻瘋樹籽殼乙醇提取物的DPPH·清除率大于BHT，但麻瘋樹籽殼乙醇提取物的DPPH·清除率在測定濃度范圍內(nèi)明顯均低于VC。麻瘋樹籽殼乙醇提取物的黃酮半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.185mg/mL，大于VC的0.085mg/mL，略低于BHT的0.186mg/mL，可見麻瘋樹籽殼乙醇提取物具有較強(qiáng)的DPPH·清除能力。

圖3 麻瘋樹籽殼乙醇提取物對(duì)DPPH·的清除作用Fig.3 Scavenging activity of ethanol extracts from Jatropha curcus L.seed shell on DPPH radicals

2.3 亞硝酸鹽清除作用

亞硝胺是已知致癌性最強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)之一，它可由亞硝酸鹽和胺類在人及動(dòng)物的胃中合成。因此，清除體內(nèi)亞硝酸鹽是防止癌癥的重要途徑。結(jié)果表明，NaNO2的回歸方程為Y2=0.1151x+0.0616，R2=0.9966，線性范圍為5～20mg/L。由圖4可知，在測定的黃酮質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，麻瘋樹籽殼乙醇提取物的亞硝酸鹽清除率與其黃酮質(zhì)量濃度密切相關(guān)，其半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.494mg/mL，大于 VC的0.115mg/mL，但其黃酮質(zhì)量濃度超過0.5mg/mL后，其亞硝酸鹽清除率開始高于BHT，而BHT清除率在測定范圍內(nèi)均小于50%。當(dāng)麻瘋樹籽殼乙醇提取物中黃酮的質(zhì)量濃度為1.0mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到81.63%。由此說明麻瘋樹籽殼乙醇提取物具有較強(qiáng)的亞硝酸鹽清除能力。

圖4 麻瘋樹籽殼乙醇提取物對(duì)亞硝酸鹽的清除作用Fig.4 Scavenging activity of ethanol extracts from Jatropha curcus L.seed shell on nitrite

2.4 還原力

抗氧化劑通過自身還原作用供給電子而使自由基變?yōu)榉€(wěn)定分子，失去活性，故還原力是反映抗氧化劑提供電子能力的重要指標(biāo)。待測物的還原力與吸光度大小相關(guān)，吸光度越大，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)，還原力可通過待測物吸光度大小來表示［10］。由圖5可知，麻瘋樹籽殼乙醇提取物中黃酮的質(zhì)量濃度在0.1～0.5mg/mL范圍時(shí)，其吸光度與質(zhì)量濃度之間存在劑量依賴關(guān)系;在0.7～1.0mg/mL范圍時(shí)，其吸光度基本穩(wěn)定，并與同質(zhì)量濃度的對(duì)照VC吸光度相當(dāng);當(dāng)麻瘋樹籽殼總黃酮質(zhì)量濃度超過0.3mg/mL時(shí)，其吸光度大于BHT?？梢娐榀倶渥褮ひ掖继崛∥镌诟哔|(zhì)量濃度下具有較強(qiáng)的還原力。

圖5 麻瘋樹籽殼乙醇提取物的還原力Fig.5 Reducing power of ethanol extracts from Jatropha curcus L.seed shell

2.5 總抗氧化能力

FRAP作為最簡單、快速、廉價(jià)的常規(guī)分析方法之一，目前已發(fā)展成一種直接測定供試物抗氧化能力的方法［11］。結(jié)果顯示，F(xiàn)eSO4的線性回歸方程為Y3=2.2045x+0.0935，R2=0.9999，線性范圍為 0.025～0.8mmoL/L。麻瘋樹籽殼乙醇提取物的抗氧化能力如圖6所示。在測定濃度范圍內(nèi)，其FRAP值隨著質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，且均大于BHT而小于VC。在麻瘋樹籽殼乙醇提取物的黃酮質(zhì)量濃度為1.0mg/mL時(shí)，其FRAP值為1.08mmol/L，表明麻瘋樹籽殼乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

圖6 麻瘋樹籽殼乙醇提取物的總抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant ability of ethanol extracts from Jatropha curcus L.seed shell

3 結(jié)論

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