鰱魚和草魚下腳料中CPIs抑制活性比較及其分子量分布的鑒定

李樹紅，陳 海，蔣然然，李美良，李艷芳，吳 睿，姜海洋，肖安蓬，何 杰

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014)

草魚(Ctenopharyngodonidellus)和鰱魚(Hypophthalmichthys molitrix)是我國最主要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，產(chǎn)量分別位居第一和第二位［1］。同時，在鰱魚及草魚的加工過程中，會產(chǎn)生大量內(nèi)臟、魚皮等廢棄物或下腳料。而有研究表明，魚類卵［2］、皮［3］和血漿［4］、肝胰、心臟、腎、鰓、腸［5］等中均存在半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine proteinase inhibitors，CPIs)抑制活性。

對陸生動物源CPIs的研究表明，其不僅參與機(jī)體蛋白周轉(zhuǎn)代謝，而且在生物防御［6］、抑菌［7］、細(xì)胞凋亡［8］、免疫調(diào)節(jié)［9］、疾病和癌癥抑制［10］、胚胎發(fā)育保護(hù)［11］、骨生長調(diào)節(jié)［12］等中均發(fā)揮著重要作用，因此日益受到關(guān)注。此外，在食品領(lǐng)域的相關(guān)研究表明，CPIs還可通過抑制殘留在魚糜中的內(nèi)源半胱氨酸組織蛋白酶活性，而防止魚糜凝膠的軟化［13］。目前對陸生哺乳動物CPIs研究相對較透徹，其中主要的類群Cystatins超家族包括了低分子量的家族I Stefin(約11ku)和家族II Cystatin(約13ku)，以及高分子量的家族III Kininogen(約50～120ku)中的多個成員［14］。但是對于進(jìn)化地位和生存環(huán)境不同的魚類，其CPIs在分類、結(jié)構(gòu)、活性特征、生理功能等方面的研究尚存在較多空白。

作者所在團(tuán)隊報道了鰱魚卵高分子CPIs的部分特性［15］，而關(guān)于鰱魚其他下腳料及草魚各組織中CPIs的活性分布和性質(zhì)等研究，目前尚未見報道。為此，本研究首先確定了鰱魚和草魚卵、皮中CPIs粗提、層析過程中適宜的測活方法，進(jìn)而比較了各下腳料粗提液中CPIs活性量的種間差異。在此基礎(chǔ)上，利用分子篩層析結(jié)合反相酶譜法，初步鑒定了兩種魚卵、皮各部位中CPIs分子量分布情況。本研究結(jié)果不僅可為后續(xù)的分離純化及分析工作奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，而且為依據(jù)抑制活性量的差異，充分利用鰱魚、草魚各類下腳料資源，提供理論依據(jù)，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

懷卵期(Ⅳ期)鰱魚和草魚的卵、皮均采集于四川崇州通威養(yǎng)殖中心。樣品于冰上運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，液氮速凍，于-80℃凍藏，使用前4℃解凍。

熒光合成肽(Z-Phe-Arg-MCA)、偶氮酪蛋白(Azocasein)、木瓜蛋白酶(Papain)、熒光標(biāo)品AMC、苯甲基磺酰氟(PMSF)、明膠、牛血清白蛋白(BSA)、層析用蛋白分子量標(biāo)品 美國sigma;中分子量蛋白標(biāo)品(14.3～97.4ku) 美國 promega;中分子量蛋白標(biāo)品(14.4～94ku) 北京天根;蛋白濃度試劑盒 南京建成生物有限公司;Sephacryl S-200 美國GE公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BR4i大容量高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司;8050和8003磁攪拌超濾裝置 美國Millipore公司;Varioskan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo公司;V-1200可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司;Biologic DouFlow全自動中高壓層析系統(tǒng)、Mini Protein電泳槽及PowerPac 3000電泳電源 美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鰱魚和草魚卵中CPIs的粗提取 鰱魚卵和草魚卵中CPIs的粗分離提取參照宋川［15］方法。

1.3.2 鰱魚和草魚皮中CPIs的粗提取 鰱魚/草魚皮(約30g)經(jīng)去鱗洗凈后用四倍體積的提取緩沖液(含0.1mmol/L PMSF、5mmol/L 苯甲脒、15mmol/L 疊氮化鈉、0.25mol/L蔗糖、10mmol/L乙二胺四乙酸的10mmol/L Tris-HCl pH7.4)勻漿［3］。經(jīng)離心(10000×g，20min)，取上清用四層紗布過濾，濾液經(jīng)80%硫酸銨鹽析、透析(20mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.0)后離心(10000×g，5min)，取上清液。樣液經(jīng)Amicon YM-3超濾膜(截留分子質(zhì)量為3ku)超濾濃縮得皮CPIs濃縮粗提液。樣品液氮速凍后，于-80℃保存。使用前4℃解凍。

以上步驟均在4℃操作，以分別以Z-Phe-Arg-MCA和Azocasein為底物，測定每一步驟后的粗酶液的總活力和比活?？偦?units)=反應(yīng)體系產(chǎn)生的抑制活性單位數(shù)×(CPIs提取液總體積/反應(yīng)體系中加入的 CPIs提取液體積);比活(units/mg)=總活/CPIs提取液的總蛋白

1.3.3 蛋白質(zhì)量濃度測定 采用Bradford方法，按照蛋白濃度試劑盒說明的各步驟測定提取液的蛋白濃度。

1.3.4 Azocasein法測定CPIs抑制活性 Azocasein法，即測定CPIs對Papain水解Azocasein反應(yīng)的抑制能力。Papain水解Azocasein的反應(yīng)體系基本參考Rowan等的方法［16］，但由于每個實(shí)驗(yàn)所選用的Papain來源各不相同(即酶的純度、unit不同)，為了準(zhǔn)確測定CPIs的抑制活性，必須準(zhǔn)確測定Papain酶活，因此實(shí)驗(yàn)首先需要確定該酶反應(yīng)初速度線性范圍對應(yīng)的酶加量。當(dāng)反應(yīng)體系中含2.5mg Azocasein時，37℃ 下測定不同質(zhì)量(3.125、6.25、7.8125、12.5、18.75、21.875、25μg)Papain 在 30min 內(nèi)的酶反應(yīng)曲線，取其線性部分作為適宜的酶用量和反應(yīng)時間。此后，調(diào)節(jié)CPIs的加入量，使測得的對木瓜蛋白酶的抑制率在30%～70%之間［17］。CPIs的抑制活性單位定義為:反應(yīng)條件(37℃、pH7.0)下，440nm處吸光值降低0.01即為一個單位。

抑制比率(%)=(對照管酶活-實(shí)驗(yàn)管酶活)/對照管酶活×100

1.3.5 熒光合成肽法測定CPIs抑制活性 熒光合成肽法，即測定CPIs對Papain水解熒光合成肽Z-Phe-Arg-MCA反應(yīng)的抑制能力，基本參考Barrett等［18］和 Anastasi等［19］的方法。該方法中首先要求對Papain(本實(shí)驗(yàn)配制的原始濃度為1.25mg/mL)的有效摩爾濃度進(jìn)行定量，其具體方法基本參考Barrett等［18］的E-64活性位點(diǎn)滴定法，即測定不同E-64濃度(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、15μmol/L)下，Papain(1.25mg/mL)的殘余活性。由已知的E-64摩爾濃度計算Papain(1.25mg/mL)的有效摩爾濃度。此外，根據(jù)文獻(xiàn)在適宜的Z-Phe-Arg-MCA水解反應(yīng)體系中，為保證酶反應(yīng)處于線性范圍，8nmol/L Papain的適宜加量范圍為20～50μL。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計了12.5、25、37.5、50μL 的 Papain 加量，在此范圍內(nèi)進(jìn)行測定以判斷酶反應(yīng)初速度的線性情況。最后在測定CPIs的抑制活性時，調(diào)節(jié)CPIs的加入量，使測定的抑制率在30%～70%之間［17］。上述反應(yīng)所用溫度為40℃，檢測波長為激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長440nm。酶活單位定義為:在反應(yīng)條件(40℃、pH6.8)下，能夠在1min內(nèi)水解底物并釋放出1nmol AMC產(chǎn)物的酶活性量(1nmol AMC/min)。抑制活性單位定義為:抑制1個單位的酶活性。

1.3.6 Sephacryl S-200分子篩層析 取上述兩種魚的卵及皮的濃縮粗提液，經(jīng)微濾后4℃下分別上Sephacryl S-200分子篩(1.0cm×90cm)。用含0.2mol/L NaCl的20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0)洗脫，流速0.07mL/min，每管收集1.0mL，檢測波長為280nm。分別以Azocasein法和熒光合成底物肽法測定每個收集管中的CPIs抑制活性，對監(jiān)測效果進(jìn)行比對。收集活性部分，濃縮后用于鑒定分析。

1.3.7 分子篩層析法測定鰱魚和草魚卵、肝、皮CPIs的分子質(zhì)量 以分子篩層析標(biāo)品藍(lán)色葡聚糖-2000測定Sephacryl S-200分子篩層析柱(1.0cm×90cm)的空體積 V0，分別以分子質(zhì)量為 150、66、36、24、13、3.5ku的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為層析標(biāo)品，相同條件下進(jìn)行層析，求得各自的洗脫體積Ve。以Ve與V0的比值作為縱坐標(biāo)(y)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量對數(shù)為橫坐標(biāo)(x)作圖，求得Sephacryl S-200分子篩層析標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.8 明膠底物-SDS-PAGE-反相酶譜法分析 反相酶譜中SDS-PAGE參考Laemmli體系［20］。采用含0.2%明膠的14%分離膠，樣品上樣緩沖液中不含β-巰基乙醇，上樣前樣品不煮沸。電泳結(jié)束后，蛋白酶抑制的復(fù)性活性帶的形成在 García-Carreňo 等［21］的方法基礎(chǔ)上略有改動。用含2.5%Triton-100、1mmol/L DTT的50mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0漂洗復(fù)性凝膠3次，15min/次;再用雙蒸水漂洗凝膠3次，15min/次。復(fù)性后的凝膠于含0.4mg/mL木瓜蛋白酶的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中4℃浸泡1h。最后用50mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)37℃反應(yīng)9～12h?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色，脫色液(95%乙醇∶冰醋酸∶蒸餾水 =4.5∶0.5∶5)脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 Papain水解Azocasein酶反應(yīng)的初速度線性范圍確定

由圖1可知，當(dāng)酶反應(yīng)的底物量一定(即2.5mg)時，Papain用量≤7.8125μg，30min內(nèi)反應(yīng)呈線性;Papain用量12.5μg時，20min以內(nèi)反應(yīng)保持線性;Papain用量18.75μg時，10min以內(nèi)反應(yīng)保持良好線性。綜合考慮反應(yīng)時間及吸光值高低等因素(對于后續(xù)的抑制反應(yīng)而言，酶反應(yīng)的初始吸光值過低，不方便測定抑制活性)，最終選 Azocasein底物量2.5mg時，Papain用量18.75μg，37℃反應(yīng)10min的適宜條件。

圖1 Papain水解Azocasein的酶反應(yīng)曲線Fig.1 The curve of enzyme reaction about papain hydrolyzing azocasein

2.2 E-64滴定法測定Papain有效摩爾濃度

由圖2、圖3可見，由于E-64摩爾濃度已知，取E-64滴定曲線的線性部分，通過趨勢線(R2=0.999)，可以準(zhǔn)確測出Papain(1.25mg/mL)的有效活性濃度為6.05μmol/L。

圖2 E-64滴定曲線Fig.2 Titration curve of papain with E-64

圖3 E-64滴定曲線線性部分Fig.3 Extrapolation of linearity of E-64 titration curve

2.3 熒光合成肽水解反應(yīng)體系中8nmol/L Papain的適宜加量

由圖4可知，在8nmol/L Papain的加量為12.5～50μL范圍內(nèi)，Z-Phe-Arg-MCA水解反應(yīng)的初速度一直呈線性。因此，為方便后續(xù)測定CPIs的抑制活性，確定熒光合成肽水解反應(yīng)體系中，8nmol/L Papain的用量以50μL為宜，即反應(yīng)體系中Papain加量為0.0835μg(圖4)。

圖4 8nmol/L Papain水解熒光肽底物的反應(yīng)初速度Fig.4 Initial velocity of hydrolysis reaction of Z-Phe-Arg-MCA by 8nmol/L Papain

2.4 鰱魚和草魚卵及皮中CPIs粗分離提取及活性比較

粗提過程中，采用熒光合成肽法測定鰱魚和草魚卵及皮粗分離各步驟中CPIs抑制活性(數(shù)據(jù)省略)時，發(fā)現(xiàn)該法不能準(zhǔn)確監(jiān)測CPIs抑制比活性的變化，其原因可能是在成分相對復(fù)雜的卵、皮粗提液中，存在同樣能夠水解熒光合成肽底物的干擾酶類，如組織蛋白酶L、B［18］等。但是用Azocasein法監(jiān)測各步驟的比活是逐漸上升(表1、表2)，且鰱魚組織蛋白酶B和組織蛋白酶L(本實(shí)驗(yàn)室制備)均不水解Azocasein底物(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。因此在粗分離過程中，Azocasein法更適合用于監(jiān)測各步驟粗提液CPIs的活性和比活。

表1 Azocasein法測定鰱魚卵及皮粗提各步驟CPIs活性Table 1 Inhibitory activities of CPIs of the crude extracts from Silver carp eggs and skins by azocasein method

表2 Azocasein法測定草魚卵及皮粗提各步驟CPIs活性Table 2 Inhibitory activities of CPIs of the crude extracts from Grass carp eggs and skins by azocasein method

此外，采用Azocasein法進(jìn)行抑制活性比較，發(fā)現(xiàn)無論鰱魚還是草魚，其同質(zhì)量的卵(30g)和皮(30g)的粗提液中CPIs總活性，均是卵明顯高于皮;但是對于CPIs抑制比活，則是鰱魚皮(14.14units/mg)高于鰱魚卵(3.98units/mg)，草魚卵(332units/mg)高于草魚皮(87units/mg);另一方面，將相同組織的提取液中CPIs抑制活性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)同質(zhì)量的卵(30g)和皮(30g)中，草魚卵和皮中的總活、比活(卵:349600units、332units/mg，皮:25600units、87units/mg)，均分別顯著高于鰱魚卵和皮中的總活、比活(卵:10620units、3.98units/mg，皮:3726units、14.14units/mg)。同質(zhì)量的草魚卵及皮中CPIs的抑制活性量和比活均極顯著高于同期的鰱魚，可能與魚種間差異有關(guān)，一方面可能CPIs的表達(dá)量在草魚卵及皮組織中高于鰱魚，另一方面可能草魚CPIs的抑制能力強(qiáng)于鰱魚，這尚待通過測定兩種魚純化后的CPIs的Ki值以及測定CPIs在mRNA及蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)量加以分析判斷。

2.5 鰱魚和草魚卵及皮粗提CPIs的Sephacryl S-200分子篩層析

Sephacryl S-200層析過程中，分別采用熒光合成肽底物法和Azocasein法對各個收集管進(jìn)行抑制活性測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在azocasein反應(yīng)體系允許的最大抑制劑加量下(100μL)，仍無法檢測到有效的抑制活性，而在靈敏度高的熒光合成肽底物法反應(yīng)體系中，只需根據(jù)層析樣品的濃度加入20～50μL收集液，即可檢測到有效的抑制活性。

在粗提取過程中，雖然熒光合成肽底物法不能有效監(jiān)測到CPIs的抑制活性，但是已有報道酸處理可以將可逆結(jié)合的內(nèi)源半光氨酸組織蛋白酶與其抑制因子CPIs分開［22］。因此，在后續(xù)的 Sephacryl S-200分子篩層析過程中，可能由于分子量不同，干擾酶與CPIs徹底分離，所以熒光合成肽底物法能夠監(jiān)測到層析收集液中CPIs的抑制活性。而且該法靈敏度高，體系中所需 Papain的量(0.0835μg)僅為Azocasein法(18.75μg)的1/225，所以當(dāng)收集液中目的蛋白被層析緩沖液高倍稀釋后，該法便體現(xiàn)出優(yōu)勢。

根據(jù)計算得到Sephacryl S-200分子篩層析的標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，為y=-0.6685x+4.5345，R2=0.9686。根據(jù)在Sephacryl S-200分子篩層析上活性峰尖處(如圖5中各虛橫線所示)的Ve與V0的比值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式初步推測，鰱魚卵中CPIs分子量約分布在119ku(35100s)、53.8ku(42300s)、14.3ku(54000s)和7.7ku(63000s)處，鰱魚皮中CPIs分子量約分布在68～112ku(36000～39600s)、19ku(51300s)和 7ku(63900s)附近。草魚卵在 50～128ku(34200～45000s)、11.6ku(55800s)和 7.7ku(63000s)附近有活性CPIs分布;草魚皮約在119ku(35100s)、53.8ku(42300s)和8.6ku(58500s)處有活性CPIs分布。而且兩種魚在小于20ku的低分子處，其CPIs抑制比活均明顯高于50～120ku的高分子處。

2.6 CPIs的Sephacryl S-200收集物的反相酶譜鑒定

收集鰱魚、草魚卵及皮的Sephacryl S-200分子篩層析中高、低分子量CPIs的活性峰尖，分別進(jìn)行明膠底物-SDS-PAGE-反相酶譜的鑒定。如圖6所示，以鰱魚皮和草魚卵中高分子部分CPIs的反相酶譜圖為例(鰱魚卵和草魚皮高分子CPIs亦可得到清晰鑒定，電泳圖省略)，對照蛋白BSA條帶以及樣品泳道中的非抑制劑條帶，在反相酶譜中幾乎水解殆盡，而CPIs抑制條帶在反相酶譜中則清晰可見。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過反相酶譜鑒定到的CPIs抑制條帶均為高分子形式。對Sephacryl S-200層析圖上高分子部分抑制活性峰較寬的鰱魚皮(36000～39600s，68～112ku)和草魚卵(34200～45000s，50～128ku)，結(jié)合反相酶譜鑒定，可基本得到確定的抑制條帶位置(如箭頭所示)。此外，鰱魚皮中還檢測出約30ku的CPIs。但是，對于分子量小于20ku的低分子CPIs，兩種魚的各個組織中都未得到鑒定(圖省略)。

圖5 鰱魚和草魚卵及皮中CPIs的Sephacryl S-200分子篩層析Fig.5 Sephacryl S-200 chromatography of CPIs from eggs and skins of Silver carp and Grass carp

目前僅Okamoto報道通過反相酶譜法能夠鑒定日本鰻魚(Anguilla japonica)的16ku的類凝集素類的Eel-CPI-2［23］。而本研究中，盡管層析活性監(jiān)測表明鰱、草各下腳料組織中低分子CPIs部分的抑制比活性顯著高于高分子部分，特別是草魚卵和皮中的總活和比活都分別顯著高于鰱魚卵和皮，但是在反相酶譜中兩種魚的低分子CPIs部分均未能得到鑒定。一方面可能是鰱、草中低分子CPIs在初步純化物中含量過低，不易檢出;另一方面對鯉魚小分子Cystatin(家族II成員)的同源模型研究表明其表面均勻分布正電荷［24］，而鰱魚和鯉魚同屬鯉科，所以可能正如我們之前的分析［25］，電泳中帶負(fù)電荷的非離子型去垢劑SDS會導(dǎo)致其構(gòu)象改變，進(jìn)而喪失抑制活性。因此，對粗分離純化的鰱、草中低分子CPIs進(jìn)行初步鑒定時，反相酶譜法雖然可以基本確定高分子CPIs的分子量分布情況，但是仍存在局限性，需與分子篩層析結(jié)合，并采用有效的活性監(jiān)測方法——熒光合成肽底物法，才能夠鑒定到小分子CPIs的存在和分布。

圖6 鰱魚皮及草魚卵中CPIs的反相酶譜分析Fig.6 Reversed-phase enzyme spectrometry of CPIs in silver carp skin and grass carp egg

已有學(xué)者從某些魚類卵、皮、血漿組織中分離純化了 9ku 到 18ku 的各種低分子量［2，23，26-27］及 45.8ku到 72.6ku 的各種高分子量［3，4，28］形式的 CPIs，而且不同魚種中純化的 CPIs 的 Ki差異明顯［4，26-27，29］。目前除作者所在實(shí)驗(yàn)室從鰱魚卵中分離了89ku的高分子CPI［15］和 10ku 的低分子 CPI［30］，尚未見對鰱魚皮和草魚下腳料中CPIs分子量分布和分離純化的報道。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)分子篩層析初步鑒定出鰱、草各下腳料組織中均存在多種高(50～120ku)、低分子量(＜20ku及＜10ku)形式的CPIs，但它們分別屬于哪類家族、各自的生物學(xué)活性特征等，還有待進(jìn)行深入純化、鑒定研究。

3 結(jié)論

本文利用適宜體系的Azocasein反應(yīng)法分析測定了鰱、草魚下腳料(卵、皮)粗提液中CPIs的抑制活性差異。進(jìn)而通過Sephacryl S-200分子篩層析分析，并根據(jù)熒光合成肽法監(jiān)測到的CPIs活性峰位置，同時結(jié)合明膠底物-SDS-PAGE反相酶譜法，初步判斷兩種魚卵和皮組織中CPIs的分子量分布情況，即均存在高(50～128ku)及低(7～19ku)分子量的形式。

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