利用分子標記輔助選擇培育轉Bt 基因抗蟲水稻

張 琳，魏志剛，裴婷婷，胡頌平，余 霞，張 靜，羅利軍，葉水峰，劉國蘭

(1.江西農業(yè)大學 理學院，江西 南昌 330045;2.江西農業(yè)大學 生物科學與工程學院，江西 南昌 330045;3.上海市農業(yè)生物基因中心，上海 201106)

水稻是最重要的糧食作物之一，是世界1/3 人口的主要糧食來源。而蟲害是造成水稻減產(chǎn)的主要原因之一，其中水稻鱗翅目害蟲如二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等是我國水稻生產(chǎn)中的主要害蟲。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年因蟲害造成的經(jīng)濟損失就達近百億美元。因此，培育抗螟蟲的水稻新品種具有十分重要的現(xiàn)實意義和應用前景。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性菌，屬于原核生物細菌綱芽胞桿菌科芽胞桿菌屬，廣泛存在于自然界［1］。1901 年日本學者首次分離出Bt 菌，并證明它對部分鱗翅目昆蟲有毒性作用。1953 年發(fā)現(xiàn)Bt 菌的殺蟲活性與伴胞晶體有關［2］，并證實這種伴胞晶體由蛋白質組成［3］。這種蛋白通常被稱作δ-內毒素(δ-endotoxins)或殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)。隨著人們對Bt 菌及其所產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白研究的逐步深入，人們已從不同的Bt 菌的亞種中分離出對不同昆蟲(如鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等)和無脊椎動物(如螨類、寄生線蟲、原生動物等)有特異毒殺作用的殺蟲晶體蛋白。

Schnepf 和Whiteley［4］將Bt 庫斯塔克亞種菌株HD-1 中的殺蟲晶體蛋白基因克隆到大腸桿菌的質粒中，克隆了第1 個Bt 殺蟲晶體蛋白基因［4］。Zambryskpi［5］則在1983 年成功的獲得了第1 株轉基因煙草，這兩個試驗的成功促使了轉Bt 抗蟲植物的出現(xiàn)。隨后，有學者將Bt 基因轉入煙草［6-8］、西紅柿［9］、棉花［10］等獲得了相應的轉Bt 基因植物。但獲得的這些早期的轉Bt 基因植株的抗蟲性都很弱，難以檢測出mRNA 的轉錄，蛋白質表達量很低?？赡芎鸵吧鶥t 基因的AT 含量高和(或)密碼子使用偏愛有關。因此，要使得Bt 基因在轉基因植物中高效表達，必須對野生Bt 基因進行有效的改造。1990 年，Perlak 等［10］通過使用人工修飾過的cryIA(b)和cryIA(c)基因獲得了轉Bt 基因的棉花。cryIA(b)和cry-IA(c)基因在植物中的表達水平大大提高，其蛋白含量占到了植株總可溶蛋白的0.05%～0.1%，其抗蟲效果可以滿足農業(yè)上的應用［10］。郭三堆等［11］人工合成了全長1 824 bp 的cry1Ab 和cry1Ac 融合的GFM 殺蟲基因，結果Bt 毒蛋白在植物中的表達量提高了約100 倍［11］。第1 例Bt 轉基因水稻是由Wünn 等［12］獲得。而Maqbool［13］則報道了在1999 年首次獲得了雙價的Bt(cry1Ac+cry2A)水稻。Tu［14］則在2000 年首次報道了轉Bt 水稻的田間試驗。到目前為止，已經(jīng)有大量的轉Bt 基因水稻的報道。林擁軍［15-16］經(jīng)人工改造獲得具有自主知識產(chǎn)權的兩個抗蟲基因:cry1C*和cry2A*，并培育出高抗的轉基因品系T1C-19 和T2A-1。這兩個轉基因品系及其配制的雜種對二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲的抗蟲效率大于95%。為了更有利于推動抗蟲轉基因水稻的商品化，Ye 等［17］采用胚乳特異不表達的rbcS 啟動子來驅動cry1C*基因，得到的轉基因株系具有高抗蟲性，Cry1C 蛋白在葉片和莖稈中高表達，而在胚乳的表達量極低［17］。

目前，水稻生產(chǎn)主要采取噴灑殺蟲劑來控制蟲害。雖然化學殺蟲劑在減少蟲害損失起到了巨大作用，但是它的使用不可避免的造成環(huán)境污染以及威脅人類健康，而且提高了農業(yè)生產(chǎn)的成本。通過大規(guī)模的篩選，目前在水稻及其近緣種中還沒有發(fā)現(xiàn)二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲的抗性種質資源，因此無法通過常規(guī)育種及分子標記輔助選擇技術方式來培育抗蟲水稻新品種。通過轉基因育種的手段增強水稻自身的抗蟲性是解決上述問題的有效途徑。Bt 基因是來自于蘇云金芽胞桿菌的一種殺蟲基因，其表達的蛋白產(chǎn)物可特異性毒殺不同的害蟲，而且對人畜和環(huán)境無害，是目前轉基因育種中主要使用的抗蟲基因。應用轉基因培育抗蟲水稻是現(xiàn)階段及未來解決水稻蟲害問題的主要策略。

本研究的目的是通過傳統(tǒng)雜交的方法將3 個Bt 明恢63 中的Bt 基因，轉育到水稻品種秀水123、湘晴及節(jié)水抗旱稻恢復系旱恢3 號和保持系滬旱1B 中。利用分子標記輔助選擇、田間除草劑篩選或者試紙條檢測方法，以獲得新型轉Bt 基因株系，并篩選出抗蟲性良好、農藝性狀優(yōu)良的株系，為后續(xù)抗蟲育種提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供體植物材料 本試驗研究的水稻材料為Bt 明恢63 株系:TT51(cry1Ac/Ab)、T1C-19(cry1C*)、T2A-1(cry2A*)，以上材料來自華中農業(yè)大學林擁軍教授。

1.1.2 受體材料 受體親本為常規(guī)粳稻品種秀水123，恢復系湘晴以及節(jié)水抗旱稻恢復系旱恢3 號和保持系滬旱1B。

1.1.3 供試昆蟲 中進行大田抗蟲鑒定試蟲為水稻主要鱗翅目害蟲之一:稻縱卷葉螟。

1.1.4 試劑 1.5×CTAB;氯仿/異戊醇(24∶1);引物(序列見表1，由Invitrogen 公司合成)Taq 酶;Buffer;dNTP;瓊脂糖;溴酚藍;EB;Basta 試劑(除草劑)等。

表1 Bt 基因擴增引物Tab.1 Amplification primer of Bt gene

1.2 實驗方法

1.2.1 研究技術路線 利用抗蟲轉基因新材料T1C-19(攜帶cry1C*基因)、T2A-1(攜帶cry2A*基因)和TT5-1(攜帶cry1Ab/Ac 融合基因)為供體材料，以秀水123、湘晴、旱恢3 號和滬旱1B 為受體材料，進行有性雜交和回交，并通過自交來獲得純合轉Bt 基因株系(圖1)。本研究主要是對回交二代自交三代(BC2F3)進行分子標記陽性檢測，得到純合轉Bt 基因株系。同時，采用田間除草劑篩選、試紙條檢測方法及田間抗蟲鑒定等方法來鑒定是否純合。

圖1 研究技術路線Fig.1 The route of study technique

1.2.2 分子標記陽性檢測 (1)水稻葉片總DNA 提取:采用小量DNA 抽提法(CTAB 法)。

(2)PCR 擴增:采用常規(guī)PCR 擴增。

(3)電泳檢測。1)瓊脂糖凝膠電泳:①制膠。a.6 g 瓊脂糖加到盛有275 mL 0.5×TBE 的錐形瓶中煮沸10 min 至瓊脂糖充分溶解;b.當錐形瓶溫度將為60 ℃左右加入12 μL 的EB 混合均勻;c.將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，在適當?shù)奈恢貌迳鲜嶙?d.在室溫下使膠凝固，之后拔出梳子將膠放入電泳槽中。②點樣。模板DNA 8 μL，Maker 4 μL。③0.5×TBE 緩沖液中120V 電壓跑膠至溴酚藍跑到底。④將膠置于紫外光下觀察，拍照記錄。2)聚丙烯酰胺凝膠電泳:采用常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.3 轉基因植株的除草劑抗性檢測 由于轉基因植物具有抗除草劑的特性，可以利用噴灑除草劑的方法來檢測轉基因植株。轉基因植株的除草劑抗性檢測方法主要有兩種:Basta 溶液涂抹葉片和Basta 溶液直接噴灑。本研究采用后一種，配制終濃度為0.3%的Basta 直接在田間噴施水稻植株，7 d 后進行觀察。

1.2.4 轉基因植株的試紙條檢測 取標記檢測陽性植株葉片，加自來水于碾缽中磨碎，取汁液于離心管中，將膠體金試紙置于汁液中，觀察結果。

1.2.5 轉基因植株的田間抗蟲鑒定 全生育期實行除不噴施農藥外的正常田間管理，觀察轉基因植株對卷葉螟的抗性。田間種植材料整個生育期不打藥，通過自然發(fā)蟲進行材料選擇，由于近年螟蟲危害較重，田間篩選結果較好。在田間共種植有BC2F3材料，根據(jù)檢測的陽性植株以及田間發(fā)蟲情況來進行選種，選擇了植株表現(xiàn)上與輪回親本接近的，且抗蟲的材料共270 份材料。

2 結果

2.1 分子標記陽性檢測結果

對所獲得2A 材料93 份，1C 材料112 份，1Ab/Ac 材料65 份進行水稻植株提取DNA，通過PCR 及瓊脂糖電泳檢測，因為Bt 基因是顯性的，因此在BCnF1 代有擴出對應條帶的為陽性植株(圖2、3、4)。而自交后的植株中如果全部的單株都能擴增出Bt 基因，則為純合株系。BC2F3代PCR 檢測的結果顯示分別獲得cry1C*和cry2A*基因的一些純合株系(表2)，而cry1Ac/Ab 暫還未獲得純合株系，需下一代自交挑選。

表2 BC2F3代純合株系Tab.2 Homozygous lines of BC2F3

圖2 Cry2A* 瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.2 Agarose gel electrophoretogram of Cry2A*

圖3 Cry1C* 瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.3 Agarose gel electrophoretogram of Cry1C*

圖4 Cry1Ab/Ac 瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.4 Agarose gel electrophoretogram of Cry1Ab/Ac

圖5 田間噴施Basta 試驗.Fig.5 Experiment of spraying Basta in field

2.2 轉基因植株的Basta 噴施試驗結果

除常規(guī)的PCR 檢測外，對cry1C*和cry2A*植株進行0.3%的Basta 噴施檢測，進一步確認陽性植株。在BC2F3代進行的純合株系挑選，若為純合株系，則所有單株均不受Basta 損害;而雜合的則出現(xiàn)3∶1 的分離比(陽性:陰性)，本次實驗雜合植株總株數(shù)為192 株，其中表現(xiàn)陽性的為144 株，表現(xiàn)陰性的為48 株;全部死亡的則為陰性株系(圖5)。

2.3 試紙條檢測結果

除常規(guī)的PCR 檢測外，對轉基因植株進行膠體金試紙進行蛋白的陽性鑒定。進一步確保篩選結果的可靠性(圖6)。其中cry1C*和cry2A*標記結果和試紙條檢測結果相吻合。而對于Cry1Ab/Ac，PCR 結果陽性，但試紙檢測卻為假。

圖6 試紙條檢測結果Fig.6 Results of test paper detection

2.4 田間稻縱卷葉螟抗性鑒定結果

2011 年夏在上海白鶴轉基因試驗基地進行材料的稻縱卷葉螟抗性鑒定。已轉入Bt 基因的植株對稻縱卷葉螟表現(xiàn)出高抗性，卷葉率為0;而陰性植株則被侵食，卷葉率平均達37.8%(圖7)。此外，含cry2A*植株的抗性相對較差，有個別植株受輕微影響，有1～2 片葉片被侵害。

圖7 田間自然感蟲試驗結果Fig.7 Results of natural affection of rice leaf roller in field

3 討論與結論

在轉基因植株檢測中普遍PCR 檢測的假陽性結果較多，給進一步的檢測造成麻煩。Cry1Ab/Ac 的問題，PCR 結果陽性，但試紙檢測卻為假。所以Cry1Ab/Ac 暫未獲得純合株系，需進一步自交。

在選擇瓊脂糖凝膠電泳檢測供體-受體間差異標記時，產(chǎn)物不清晰，即在3%瓊脂糖凝膠電泳中，供體與受體條帶一致，需用5%聚丙烯凝膠電泳才能檢測出差異。而聚丙烯酰胺凝膠在制備過程中會受到很多因素的影響:首先是催化劑AP(過硫酸銨)與加速劑TEMED(二甲基乙二胺)濃度。適量的AP與TEMED 促進聚合，但當其過量時會引起電泳時烘膠和譜帶變形。且溫度高時聚合快，所以應選擇合適配方使聚合在40～60 min 中內完成。Acr(單體丙烯酰胺)與交聯(lián)劑Bis(N，N-甲叉丙烯酰胺)的濃度也是影響凝膠形成的重要因素。此外溫度，pH，氧分子都會對凝膠的形成及凝膠的質量造成影響。

本實驗在使用最普遍的分子標記輔助選擇轉Bt 基因水稻同時［18］，采用田間除草劑篩選;試紙條檢測方法;田間抗蟲鑒定等方法相結合篩選出抗蟲性良好、農藝性狀優(yōu)良的株系，為后續(xù)抗蟲育種提供材料。多種方法并用的優(yōu)勢是節(jié)省工作量以及增強結果準確性等。通過直接對生長期水稻葉片噴灑Basta 實驗，若為陰性植株則單株死亡，可以通過此方法來減少需要進行PCR 陽性檢測的植株數(shù)量;此外也可以利用此方法來檢測通過分子標記輔助選擇的植株是否為假陽性，因為假陽性植株在噴灑Basta 液體后一周內會死亡。試紙條檢測方法是一種高效、簡便、易操作、準確率高的一種方法。將待測水稻葉片加水磨成液體后利用試紙條可在一、兩分鐘內判斷出所測材料為陰性還是陽性。且Cry1Ab/Ac 的為假陽性正是通過試紙條檢測方法檢測出來的。而田間抗蟲鑒定則是檢測材料植株是否抗蟲及抗性強弱的田間實際標準。

通過轉基因育種的手段增強水稻自身的抗蟲性，在實踐中篩選出抗蟲性良好、農藝性狀優(yōu)良的株系，這依然需要更多的時間與實踐。

本試驗經(jīng)BC2F3代PCR 檢測及試紙條檢測的結果顯示分別獲得cry1C*和cry2A*基因的滬旱1B、秀水123 和湘晴的純合株系。同時，在田間自然誘發(fā)蟲害條件下，轉基因株系對稻縱卷葉螟蟲表現(xiàn)出強抗性。利用分子標記輔助選擇(MAS)等技術可以培育出抗蟲性、農藝性狀優(yōu)良的轉Bt 基因水稻株系或品種。

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