雷公藤內(nèi)酯對(duì)老年大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙海馬TNF-α表達(dá)的影響

商雄躍，高鐵梅，褚慶霞

(江蘇省南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院1.重癥醫(yī)學(xué)科;2.麻醉科;3.呼吸內(nèi)科，江蘇南京 211800)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是指手術(shù)麻醉后數(shù)天內(nèi)發(fā)生的一種可逆的、具有波動(dòng)性的急性精神紊亂綜合征［1］。臨床上術(shù)后認(rèn)知功能障礙比較常見(jiàn)，特別是老年人發(fā)病率較高，但病因、病情復(fù)雜多樣，容易受到忽視。術(shù)后認(rèn)知功能障礙可導(dǎo)致患者康復(fù)延遲、住院天數(shù)延長(zhǎng)和醫(yī)療費(fèi)用增加等，嚴(yán)重時(shí)甚至影響病人出院后的生活質(zhì)量。

研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)在POCD的病理改變過(guò)程中是關(guān)鍵因素，非甾體抗炎藥物可以降低圍術(shù)期炎癥反應(yīng)，改善大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力。抑制炎癥反應(yīng)對(duì)神經(jīng)組織細(xì)胞的損害可能成為POCD防止的重要手段［2－3］。

雷公藤內(nèi)酯(tripterygium glycosides，TP)是衛(wèi)矛科植物雷公藤的去皮根部提取的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯類化合物，具有較強(qiáng)的抗炎、免疫抑制作用，且能通過(guò)血腦屏障，已成功用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等自身免疫性炎癥性疾病［4－6］。目前關(guān)于雷公藤內(nèi)酯對(duì)于POCD的作用報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察雷公藤內(nèi)酯對(duì)肝部分切除術(shù)后老年大鼠海馬TNF-α表達(dá)影響，為將來(lái)將TP用于POCD的防治提供可能的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑 健康SD大鼠56只，雌雄不限，20月齡，體重500～600 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):2112379。Y型迷宮為張家港生物醫(yī)學(xué)儀器廠生產(chǎn)。雷公藤內(nèi)酯由西安昊軒生物科技有限公司生產(chǎn)，純度＞98%。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和動(dòng)物模型的建立 用Y型迷宮初篩，去除對(duì)電擊耐受性差和對(duì)電擊不敏感的大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法，將入選大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(sham組)(n=14)，模型組(POCD組)(n=21)和TP給藥實(shí)驗(yàn)組(TP組)(n=21)。實(shí)驗(yàn)組術(shù)前1 d、手術(shù)當(dāng)日和術(shù)后1 d腹腔注射TP 0.4 mg·kg－1，共3次。假手術(shù)組和模型組腹腔注射等容積的4%丙二醇溶液。禁食12 h，自由飲水。假手術(shù)組行麻醉后打開(kāi)腹腔不予肝臟部分切除;其余大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg·kg－1，翻正反射消失后仰臥位固定，碘氟消毒后在劍突下腹部正中線切開(kāi)1.5～2.0 cm切口，進(jìn)入腹腔分離左側(cè)葉肝臟，在遠(yuǎn)端蒂部用1號(hào)絲線結(jié)扎后切除肝左葉。止血后逐層關(guān)腹。

1.3 認(rèn)知功能測(cè)試 術(shù)后1、7 d時(shí)各取7只大鼠，采用Y型迷宮檢測(cè)術(shù)后第1、2、3、7、8、9天時(shí)的學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將大鼠放入迷宮中適應(yīng)3～5 min，然后以無(wú)規(guī)則次序變換安全區(qū)，以訓(xùn)練大鼠辨別燈光刺激及安全方位的能力。每個(gè)實(shí)驗(yàn)日對(duì)每只大鼠進(jìn)行20次訓(xùn)練，以大鼠在足底通電后10 s內(nèi)一次性跑向安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯(cuò)誤反應(yīng)。于每天19:00～22:00進(jìn)行Y型迷宮實(shí)驗(yàn)，采用固定次數(shù)隨機(jī)不休息法記錄大鼠全天總反應(yīng)時(shí)間(一個(gè)實(shí)驗(yàn)日大鼠完成20次反應(yīng)所需時(shí)間，total reaction time，TRT)、每天出現(xiàn)錯(cuò)誤反應(yīng)的次數(shù)(error number，EN)和主動(dòng)回避次數(shù)(active avoidence times，AAT)［7－8］。

1.4 免疫組織化學(xué)染色及圖像分析 術(shù)后第3天時(shí)各取7只大鼠，大鼠經(jīng)升主動(dòng)脈插管，4%多聚甲醛(4℃，pH 7.4)灌注固定，在大腦海馬區(qū)連續(xù)冠狀面冰凍切片，片厚25 μm，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。30%過(guò)氧化氫1份+純甲醇50份混合，室溫浸泡30 min。蒸餾水洗后滴加5%BSA封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，滴加兔抗TNF-α抗體，4℃過(guò)夜。PBS洗滌2 min 3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃ 20 min。PBS洗 2 min 3次。滴加試劑 SABC，20～37℃，20 min。PBS洗5 min 4次。DAB顯色，陽(yáng)性細(xì)胞漿著色呈棕黃色。每只大鼠取3張切片，每張切片隨機(jī)取3個(gè)不同視野，采用纖維圖像分析系統(tǒng)(×100)測(cè)出TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均光密度。

2 結(jié)果

2.1 認(rèn)知功能測(cè)試的結(jié)果 與假手術(shù)組比較，POCD組大鼠術(shù)后1 d全天總反應(yīng)時(shí)間、錯(cuò)誤反映次數(shù)、主動(dòng)回避次數(shù)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，術(shù)后7 d全天總反應(yīng)時(shí)間、錯(cuò)誤反映次數(shù)、主動(dòng)回避次數(shù)發(fā)生明顯改變(P＜0.05)。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后8 d全天總反應(yīng)時(shí)間明顯縮短(P＜0.05)，術(shù)后 2、3、7、8、9 d 錯(cuò)誤反映次數(shù)明顯減少(P ＜0.05)，術(shù)后2、3、7、8 d 主動(dòng)回避次數(shù)明顯增加(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 肝部分切除術(shù)后各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較(±s)

表1 肝部分切除術(shù)后各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較(±s)

注:*與模型組比較，P ＜0.05:△與假手術(shù)組比較，P ＜0.05。

主動(dòng)回避次數(shù)假手術(shù)組 —組別 術(shù)后 全天總反應(yīng)時(shí)間/min錯(cuò)誤反映次數(shù)6.2 ±1.7 9.6 ±2.2 1.4 ±0.4模型組1 d 5.4 ±1.6 1 0.8 ±2.5 0.9 ±0.7 2 d 4.7 ±0.4 7.1 ±2.3 3.5 ±0.9 3 d 4.7 ±0.4 5.4 ±2.1 4.5 ±1.2 7 d 4.9 ±0.5△ 6.7 ±2.1△ 3.8 ±0.7△8 d 4.7 ±0.8 6.3 ±1.8 3.7 ±1.1 9 d 4.5 ±0.3 2.7 ±0.8 6.7 ±1.3實(shí)驗(yàn)組7.0 ±1.4 1 d 6.6 ±1.3 9.5 ±2.3 1.0 ±1.1 2 d 5.6 ±1.7 3.1 ±1.1* 6.7 ±1.1*3 d 5.2 ±1.2 2.2 ±0.7* 7.2 ±1.9*7 d 4.9 ±0.8 3.1 ±0.7* 6.4 ±0.9*8 d 3.7 ±0.7* 3.6 ±0.8* 6.5 ±1.5*9 d 2.9 ±0.6* 1.7 ±0.5*

2.2 免疫組織化學(xué)染色及圖像分析 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬區(qū)TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均光密度明顯增加(P＜0.05);與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬區(qū)TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均光密度明顯降低(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

重大手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致患者免疫系統(tǒng)的激活，引起神經(jīng)系統(tǒng)中炎性細(xì)胞因子(IL-1、IL-2、TNF)的釋放，造成中樞Ach、5-HT和NE等遞質(zhì)系統(tǒng)的紊亂，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥反應(yīng)，通過(guò)炎癥因子介導(dǎo)從而造成與海馬功能變化相關(guān)的POCD［9］，神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和外周可迅速釋放白細(xì)胞介素IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子(TNF-α)等多種炎癥因子，可引起其他炎癥介質(zhì)滲透到腦損傷部位，激活次級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，其中TNF-α可能發(fā)揮了相對(duì)重要作用。

表2 各組大鼠海馬TNF-a陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均光密度值(n=5，±s)

表2 各組大鼠海馬TNF-a陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均光密度值(n=5，±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05:與模型組比較，△P ＜0.05。

組別 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 平均光密度值假手術(shù)組1 9.8 3 ±4.1 0.2 5 2 ±0.0 1 4模型組 64.7 5 ±1 1.34* 0.3 93 ±0.0 2 1*實(shí)驗(yàn)組 5 1.6 3±7.47△ 0.3 5 1±0.0 1 6△

TNF-α是一種單核因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種多效性炎癥因子，對(duì)機(jī)體中幾乎所有器官都能產(chǎn)生效應(yīng)。急慢性機(jī)體炎癥反應(yīng)使促炎癥因子TNF-α的表達(dá)，并可通過(guò)炎癥免疫應(yīng)答對(duì)大腦產(chǎn)生影響。最新的研究發(fā)現(xiàn)TNF-α具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)與大腦功能，過(guò)多的TNF-α表達(dá)可致大鼠認(rèn)知功能發(fā)生衰退。通過(guò)抗TNF-α治療并與對(duì)照組比較，認(rèn)知功能有明顯的改善。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠海馬區(qū)TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均光密度與假手術(shù)組比較明顯增加(P＜0.05)，提示TNF-α的高表達(dá)對(duì)認(rèn)知功能障礙的形成起著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠術(shù)后1 d全天總反應(yīng)時(shí)間、錯(cuò)誤反映次數(shù)、主動(dòng)回避次數(shù)與假手術(shù)組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，可能與戊巴比妥鈉的麻醉殘留作用有關(guān)。術(shù)后7 d全天總反應(yīng)時(shí)間、錯(cuò)誤反映次數(shù)、主動(dòng)回避次數(shù)與假手術(shù)組比較發(fā)生明顯改變(P＜0.05)，表明肝部分切除術(shù)后，模型組大鼠產(chǎn)生了認(rèn)知功能障礙，本實(shí)驗(yàn)建立模型是成功的。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)雖然可以對(duì)創(chuàng)傷、應(yīng)激和感染做出防御反應(yīng)，但是可能存在延遲，不像外周組織那樣迅速產(chǎn)生粒細(xì)胞趨化和聚集。由于血腦屏障的保護(hù)作用，一般情況下僅T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)入腦組織，炎癥因子的表達(dá)水平和活性均較低。因此，以往觀點(diǎn)認(rèn)為大腦是免疫特赦(immune privilege)器官。雷公藤內(nèi)酯(tripterygium glycosides，TP)能通過(guò)血腦屏障，對(duì)炎癥早期毛細(xì)血管通透性增加引起的滲出和水腫有明顯抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后8 d全天總反應(yīng)時(shí)間明顯縮短(P ＜0.05)，術(shù)后2、3、7、8、9 d 錯(cuò)誤反映次數(shù)明顯減少(P ＜0.05)，術(shù)后 2、3、7、8 d主動(dòng)回避次數(shù)明顯增加(P ＜0.05)，表明雷公藤內(nèi)酯明顯減輕肝部分切除術(shù)后大鼠認(rèn)知功能障礙。

本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠海馬區(qū)TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均光密度與假手術(shù)組比較明顯增加(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬區(qū)TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均光密度與模型組比較明顯降低(P＜0.05)，提示雷公藤內(nèi)酯明顯減輕肝部分切除術(shù)后大鼠認(rèn)知功能障礙可能與其通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，減少TNF-α表達(dá)有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)表明TNF-α與POCD的發(fā)生有相關(guān)性，并支持著POCD是炎癥性疾病的可能機(jī)制。但 TNF-α是否在POCD的發(fā)生中起決定性的獨(dú)立因素及其表達(dá)水平的減低是否能使POCD的發(fā)生率減小，還有待于進(jìn)一步研究。

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