青藤堿微透析體外回收率研究

錢珊珊，陳玉林，桂雙英，2，3，劉明群，陳 磊

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院;2.安徽省中藥制劑工程技術(shù)研究中心;3.安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開發(fā)創(chuàng)新團隊，安徽合肥 230031)

微透析(Microdialysis，MD)是20世紀60年代在對動物腦內(nèi)的游離氨基酸和神經(jīng)遞質(zhì)的研究中提出的概念，是用于測定細胞外液中游離藥物濃度的一種新型取樣技術(shù)［1］。它是以透析原理為基礎，將探針植入目的組織，用灌流液恒速灌注探針，待測物質(zhì)沿濃度梯度經(jīng)半透膜由細胞外液擴散進入灌流液，隨著灌流液的持續(xù)流動不斷帶出體外，從而達到活體取樣的目的［2］。由于在微透析探針中，灌流液的連續(xù)灌注導致了藥物在組織液和灌注液之間的擴散不能完全達到平衡，透析液中藥物的濃度僅僅是組織液中的藥物濃度的一部分。將透析液中的藥物濃度與組織細胞液中藥物真實濃度的比值稱為相對回收率(relative recovery，RR)簡稱回收率。通過探針回收率則可計算細胞中藥物的濃度［3］。

微透析技術(shù)在藥動學研究中的應用，最早用于研究藥物向腦部的分布和轉(zhuǎn)運。近年來，大量文獻反映了微透析技術(shù)在各種不同組織藥動學應用的可行性，包括皮膚［4］、眼［5］、血液、肝臟、腎臟、膽汁、骨骼肌等［6］，微透析技術(shù)已廣泛應用于體內(nèi)藥物動力學研究［7－8］。同時可以利用多個微透析探針在不同器官及同一器官不同部位取樣。多部位微透析在闡明藥物作用機制、體內(nèi)過程等方面具有越來越明顯的優(yōu)勢，發(fā)展前景廣闊［9］。為了考察將微透析技術(shù)應用于青藤堿體內(nèi)測定的可行性以及反向透析法測定回收率的合理性，在確定探針類型等因素的情況下，通過增量法和減量法考察回收率影響因素從而為體內(nèi)反透析法測定青藤堿回收率提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ACQUITY UPLC H-Class超高液相系統(tǒng):Waters公司，包括四元泵，TUV可變波長紫外檢測器，Empower色譜工作站;瑞典CMA微透析系統(tǒng):包括灌注器推進泵(CMA400 Syringe Pump)，灌注器(CMA 2.5ml Exmire Microsypinge Ms-gan250)，收集器(CMA470 Refrigerated Fraction Collector)，線性微透析探針(CMA30，透析膜長度10 mm，膜直徑0.24 mm，截留相對分子質(zhì)量6000道爾頓);85-2A型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠);AG285電子天平(德國 sartorious);梅特勒-托利多SevenMulti型pH測試儀(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2 試藥 青藤堿對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號:0774－200206);青藤堿原料藥(純度≥98%;批號:12101704，成都曼斯特生物科技有限公司);氯化鈉(上海中試化工總公司);甲醇(色譜純，上海星可生化有限公司);氯化鉀(天津市光復科技發(fā)展有限公司);氯化鈣(西隴化工股份有限公司);三乙胺(天津市光復精細化工研究所);磷酸二氫鈉(上海中試化工總公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);流動相為甲醇 －0.01 mol·L－1磷酸二氫鈉(40∶60，三乙胺調(diào) pH 為7);流速:0.2 mL·min－1;柱溫:25℃;紫外檢測波長:263 nm［10］;進樣量:2 μL。在此色譜條件下，青藤堿出峰時間 2.2 min。

2.2 樣品制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取青藤堿對照品7.60 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解，搖勻，定容至刻度，即得濃度為304 mg·L－1的對照品儲備液，置于4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 林格氏液的制備 分別稱取8.599 5 g NaCl，0.144 3 g CaCl2，0.298 g KCl溶于水中，配成1 000 mL，用0.22 μm的水系微孔濾膜過濾即得林格氏液(Ringer’s)。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取3.75 mg青藤堿，置于50 mL 的容量瓶中，用“2.2.2“項制備的林格氏液溶解定容，即得75 mg·L－1供試品溶液。

2.3 專屬性實驗 吸取2 μL空白林格氏液，按上述色譜條件進樣，結(jié)果在青藤堿出峰位置無峰，表明空白林格氏液對青藤堿無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 對照品、供試品和空白林格氏液UPLC圖譜

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項下青藤堿對照品儲備液適量，用甲醇定容得濃度分別為7.6、15.2 、30.4、60.8、121.6 、243.2、304 mg·L－1系列溶液，按照上述色譜條件進樣測定，以青藤堿峰面積(Y)對進樣濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程:Y=9 280.6 X+6 891(r=0.999 5)，表明青藤堿濃度在7.6～304 mg·L－1之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 取高(304 mg·L－1)、中(60.8 mg·L－1)、低(7.6 mg·L－1)三個濃度的標準品溶液，連續(xù)進樣5次，結(jié)果青藤堿峰面積RSD分別為1.31%，1.06%，0.83%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12 h，按上述的色譜條件進樣，結(jié)果青藤堿峰面積RSD為1.73%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 體外微透析實驗

正透析法(即增量法)將探針沒于含藥的介質(zhì)溶液中，用不含藥的灌流液灌注，透析液中藥物濃度(Cdialysate)與介質(zhì)溶液中藥物濃度(Cmedium)之比為相對回收率RR;反透析法(即減量法)將探針沒于不含藥的介質(zhì)中，用含藥的灌流液灌注，灌流液流入和流出的濃度變化(Cperfusate-Cdialysate)與灌流的初始濃度(Cperfusate)之比為相對損失率RL。

3.1 流速對探針回收率的影響

3.1.1 增量法 將線性微透析探針完全浸沒在含有150 mg·L－1青藤堿林格氏液的100 mL燒杯中，用保鮮膜覆蓋，膜上扎兩個小孔用于插微透析探針，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，水溫維持在37℃。以空白林格氏溶液為灌流液，在不同流速(0.5，1，2，4 μL·min－1)下灌注探針，每一種流速下，收集4份微透析液(每份40 μL)，每換一種流速平衡1 h。實驗前從容量瓶中取青藤堿林格氏液進行含量測定作為初始濃度(Cmedium)，記錄峰面積，按照RR=(Cdialysate/Cmedium)×100%，計算回收率。

3.1.2 減量法 將線性微透析探針完全浸沒在空白林格氏液的100 mL燒杯中，用保鮮膜覆蓋，膜上扎兩個小孔用于插微透析探針，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，水溫維持在37℃。用150 mg·L－1青藤堿林格氏液為灌流液，在不同流速(0.5，1，2，4 μL·min－1)下灌注探針，每一種流速下，收集4份微透析液(每份40 μL)，每換一種流速平衡1 h。實驗前從容量瓶中取青藤堿林格氏液進行含量測定作為初始濃度(Cperfusate)，按照RL=(Cperfusate-Cdialysate)/Cperfusate×100%，計算相對損失率。

流速對探針回收率的影響結(jié)果見表1及圖2。隨著流速的不斷增大，探針的回收率和損失率呈下降趨勢。在相同的流速下，增量法測得的回收率和減量法測得的損失率相近。這為反向透析法測定青藤堿體內(nèi)回收率可行性提供了實驗依據(jù)。

表1 增量法和減量法測定流速對線性探針回收率的影響(n=4，±s)

表1 增量法和減量法測定流速對線性探針回收率的影響(n=4，±s)

流速/μL·min－10.5 1 2 4增量法/% 48.78 ±0.16 37.24 ±0.40 20.25 ±0.11 11.60 ±0.50減量法/% 50.64 ±0.84 38.74 ±0.29 24.60 ±0.90 13.22 ±1.04

圖2 流速對線性探針回收率的影響(n=4，±s)

3.2 濃度對探針回收率的影響

3.2.1 增量法 將線性微透析探針分別浸沒在含有3種不同濃度青藤堿林格式溶液(75、150、300 mg·L－1)的100 mL燒杯中，用保鮮膜覆蓋，膜上扎兩個小孔用于插微透析探針，水浴溫度37℃。以空白林格氏液為灌流液，灌流速度為2.0 μL·min－1灌注探針。每種濃度下收集5份微透析液，每隔20分鐘收集一次。每換一種濃度平衡1 h。實驗前分別從容量瓶中取青藤堿林格氏液進行含量測定作為初始濃度(Cmedium)，記錄峰面積，按照 RR=(Cdialysate/Cmedium)×100% ，計算回收率。

3.2.2 減量法 將線性微透析探針分別浸沒在空白林格氏液的100 mL燒杯中，用保鮮膜覆蓋，膜上扎兩個小孔用于插微透析探針，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，水浴溫度37℃。分別以含有3種不同濃度青藤堿林格式溶液(75、150、300 mg·L－1)為灌流液，灌流速度為 2.0 μL·min－1灌注探針。每種濃度下收集5份微透析液，每隔20 min收集一次。每換一種濃度平衡1 h。實驗前從容量瓶中取青藤堿林格氏液進行含量測定作為初始濃度(Cperfusate)，記錄峰面積，按照RL=(Cperfusate-Cdialysate)/Cperfusate×100%，計算相對損失率。

濃度對探針回收率的影響結(jié)果見表2和圖3。在流速為 2.0 μL·min－1時，增量法測得回收率平均結(jié)果為(21.38±1.09)%，減量法測得損失率平均結(jié)果為(24.75±0.20)%，三種濃度下回收率差異較小，表明探針回收率與濃度無關(guān)。

表2 增量法和減量法測定濃度對線性探針回收率的影響(n=5，±s)

表2 增量法和減量法測定濃度對線性探針回收率的影響(n=5，±s)

濃度/mg·L－175 150 300/% 21.24 ±0.5 20.37 ±0.34 22.54 ±0.46減量法增量法/% 24.55 ±0.52 24.94 ±0.21 24.75 ±0.19

圖3 濃度對線性探針回收率的影響(n=5，±s)

4 討論

微透析是在非平衡條件下取樣，透析液中的藥物濃度與細胞外液的濃度并不相等，其比值定義為相對回收率。因此，探針回收率是折算細胞外液中藥物真實濃度的關(guān)鍵。然而影響微透析探針回收率的因素較多，這些因素包括灌流液的流速，溫度，半透膜特性，探針的結(jié)構(gòu)，灌流液成分，管路特征以及藥物的特性［11］。本實驗采用的是商業(yè)探針，所以探針的結(jié)構(gòu)以及半透膜材料、截留分子量大小都是固定的，因此實驗中沒有加以討論。而分析物擴散系數(shù)值是隨著溫度變化的，溫度每改變1℃，分析物擴散系數(shù)值增加1%～2%。為了避免溫度對微透析回收率的影響，使測定結(jié)果更接近在體回收率。本實驗采用恒溫攪拌裝置來控制溫度，并將溫度設置為動物的一般體內(nèi)溫度37℃［12］。本文利用增量法和減量法就灌流液的流速和濃度對探針回收率的影響進行了研究，結(jié)果表明，當灌流液的流速一定時，濃度對相對回收率沒有影響，當濃度一定時，回收率隨著流速的升高不斷降低。這是因為灌流流速加快時，組織液中的待測物質(zhì)與灌注液中待測物質(zhì)交換的時間縮短引起的。

在反向透析法(本實驗中的減量法)中，藥物本身可被加入到灌流液中而且藥物的體內(nèi)損失被用作測量體內(nèi)回收率。反向透析法可以克服應用一種類似物作內(nèi)標所引入的不確定因素。應用反向透析法校正微透析探針回收率的前提條件是藥物的回收率與釋放率相近，利用藥物在灌流液中的釋放率來計算體內(nèi)的回收率，進而被用來推算細胞外液藥物的濃度。在流速為 2.0 μL·min－1，本實驗中青藤堿的回收率為20.37%，損失率為24.60%，回收率和損失率相近，從而為反透析法校正青藤堿微透析體內(nèi)回收率提供一個參考依據(jù)。

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