甘露醇保存甘薯種質(zhì)試管苗的效果

黃萍　馬朝宏++顏謙

摘 要：以貴州仁懷地方甘薯品種脫毒試管苗為試驗材料，研究不同濃度的甘露醇（2%～10%）對試管苗保存效果的影響。結果表明：甘露醇可抑制試管苗的生長，延長保存時間，其中以6%～8%的濃度最為理想，可保存試管苗11個月，成活率達35%，且不影響試管苗繼代。

關鍵詞：甘薯種質(zhì)；試管苗；甘露醇

中圖分類號：S531 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.10.020

Effect of Mannital on the Conservation of Sweet Potato Germplasm in Vitro Plantlets

HUANG Ping1，MA Chao-hong2，YAN Qian1

（1. Potato Research Institution， Guizhou Academy of Agriculture Sciences， Guiyang， Guizhou 550006， China； 2. Department of Intellectual Property， Guizhou Academy of Agriculture Sciences， Guiyang， Guizhou 550006， China）

Abstract： Virus-free plantlets of local variety of sweet potato was taken as experimental material and the multiplication culture medium supplemented with different concentration mannital （2%～10%） were used as the regard proliferation medium to study the effect of different concentration mannital on the growth and conservation of tube plantlets. The results showed that mannital could not only inhibit the growth of the tube plantlets but also prolong the conservation period. When the concentration of mannital was 6%～8%，the plantlets could be preserved at least eleven months and the survival rate was 35%，but had no significant effect on subculture.

Key words： sweet-potato germplasm； in vitro plantlets； mannital

甘薯種質(zhì)資源是甘薯育種的基礎，尤其是許多地方資源和近緣野生資源具有豐富的優(yōu)良基因。為了使甘薯優(yōu)良基因能夠得到很好的保存和利用，國內(nèi)外許多學者進行了大量深入的保存技術研究。目前，甘薯種質(zhì)資源保存方式有常規(guī)保存（即塊根貯藏）、低溫試管苗保存（18 ℃）和超低溫液氮保存（-196 ℃）[1-2]。常規(guī)保存需田間種植，費工且易受自然環(huán)境條件的影響；超低溫液氮保存在一般的實驗室難以應用；試管苗保存是當前既經(jīng)濟又實用的方法[3]，具有貯存空間小，不受自然因素及病蟲危害等特點，利于種質(zhì)的無毒保存和交換。

已報道的甘薯種質(zhì)試管苗保存主要是通過低溫、激動素、矮壯素、多效唑[4-5]、甘露醇[6]等理化處理相結合的方法，構建出甘薯試管苗緩慢生長體系，實現(xiàn)試管苗保存時間延長。Templeton-Somer和Collins[7]、唐君[6]、王意宏[8]等的研究結果均表明，在所選用的各種化學試劑中，以甘露醇處理的保存效果最好，主要表現(xiàn)在其變異最小，且形態(tài)變異在繼代中能全部回復。考慮到各研究結果之間存在差異進而影響應用效果，本項目組從已收集引進并用試管苗保存的70余份甘薯資源中篩選出一個較難保存的甘薯品種（貴州仁懷收集的地方品種）作為試材，開展甘露醇對其試管苗保存效果的研究，以尋求一種有效、安全的甘薯試管苗保存技術，為甘薯試管苗資源保存提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試甘薯品種來源于貴州仁懷，經(jīng)項目組莖尖脫毒培養(yǎng)、病毒檢測后獲得脫毒試管苗，將脫毒試管苗擴繁，培養(yǎng)35 d后篩選生長較一致的試管苗備用。甘露醇為市售、國產(chǎn)的白色粉末。

1.2 方 法

1.2.1 甘露醇濃度梯度設置 甘露醇濃度梯度為0，2%，4%，6%，8%，10%，甘露醇濃度為0的是對照。

1.2.2 甘薯脫毒試管苗保存培養(yǎng)基配制 以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加以上6個濃度梯度的甘露醇、瓊脂6 g·L-1和蔗糖20 g·L-1，調(diào)節(jié)pH值為6.0。培養(yǎng)基配制好后分裝在培養(yǎng)瓶中，每瓶50 mL，封口于高壓滅菌鍋內(nèi)常規(guī)滅菌，冷卻待用。

1.2.3 接種 將篩選出的甘薯脫毒試管苗剪切成帶一個腋芽、長約1 cm的節(jié)段并接種在滅過菌的試管苗保存培養(yǎng)基中，每瓶接種5個節(jié)段，各處理接種10瓶，3次重復。

1.2.4 培養(yǎng) 將接好種的材料置于（16±2） ℃，1 000 lx，8 h·d-1光照條件下培養(yǎng)。

1.2.5 觀察記錄 從培養(yǎng)60 d后，每30 d觀察記錄1次試管苗的株高、葉數(shù)、可用節(jié)數(shù)和成活率。測量結果取其算術平均值。

2 結果與分析

2.1 甘露醇對試管苗株高的影響endprint

甘露醇對試管苗株高有抑制作用，并隨濃度的增高抑制效果越強。如表1所示，在對照中當試管苗培養(yǎng)90 d時即可達到最大高度8.12 cm，而在添加甘露醇的處理中試管苗的株高均未達到8 cm，特別是當甘露醇的使用濃度高于4%后，株高明顯受到抑制，當使用濃度為10%時，試管苗最大高度只有3.93 cm，比對照矮4.19 cm。說明低濃度（2%）甘露醇對所試材料試管苗株高抑制效果不是太明顯，而高濃度甘露醇（≥4%）可以明顯抑制試管苗生長高度；此外，甘露醇可延緩試管苗達到最大高度的時間，一般延長60～90 d。

2.2 甘露醇對試管苗葉片數(shù)的影響

如表1，在培養(yǎng)60 d時，各處理中試管苗能達到最高葉片數(shù)，但隨甘露醇濃度的增加，葉片數(shù)在降低。其中以對照中試管苗葉片數(shù)最高，是12.07片；其次是2%甘露醇處理；10%甘露醇處理中試管苗葉片數(shù)最低，只有6.56片，比對照低5.51。培養(yǎng)60 d后，隨培養(yǎng)時間的延長和培養(yǎng)基內(nèi)水分和營養(yǎng)成分的消耗，各處理中試管苗葉片會不同程度地發(fā)生變黃死亡，葉片數(shù)量有降低趨勢；但各處理中葉片數(shù)降低的速度不盡相同，對照中葉片數(shù)降低速度最快，在培養(yǎng)180 d時就為0；2%和4%甘露醇處理中葉片數(shù)在培養(yǎng)300 d和330 d時為0，分別比對照延長了120 d和150 d；6%，8%，10%甘露醇處理中試管苗到培養(yǎng)330 d時，葉片數(shù)仍能達到5片左右。說明甘露醇能延緩葉片的衰老，隨濃度的增加延緩的作用越強。

2.3 甘露醇對試管苗可用節(jié)數(shù)量的影響

甘露醇對試管苗可用節(jié)數(shù)量的形成有抑制作用，隨使用濃度的增加，抑制效果越明顯，對照中最高可用節(jié)數(shù)為7.31，而在10%甘露醇處理中的僅為2.04，低出對照5.27（表1）。在2%和4%甘露醇處理中，當試管苗培養(yǎng)240 d后，試管苗株高雖是7.50 cm和6.00 cm，但因葉片數(shù)急劇下降，并且集中著生在試管苗頂部，導致可用節(jié)數(shù)下降幅度明顯，只有1～2個。

2.4 甘露醇對試管苗成活率的影響

添加甘露醇可延緩試管苗衰老的速度（表1）。對照中試管苗培養(yǎng)90 d起就開始有葉片發(fā)黃死亡，植株枯死現(xiàn)象發(fā)生，而2%甘露醇處理中在180 d時才發(fā)生，比對照延長了90 d；高濃度甘露醇處理（≥4%）的至少比對照延長了120 d，高的達到150 d。

試管苗培養(yǎng)90 d后，在各濃度甘露醇處理中試管苗成活率在各個觀察期均高出對照，2%和4%處理中當試管苗培養(yǎng)300 d后才為0，比對照延長了120 d和150 d；6%～10%處理中試管苗在培養(yǎng)330 d時仍達到35%左右的成活率，此時的試管苗葉色綠，根尖和須根呈現(xiàn)白色，生長正常。但因10%處理上的試管苗葉片較集中在植株頂部，不利于轉接且不利于繼代培養(yǎng)，故篩選出6%～8%的甘露醇濃度較適于試管苗保存。

3 結論與討論

研究結果表明，培養(yǎng)基內(nèi)加入甘露醇可抑制甘薯試管苗的生長和延長試管苗保存時間，篩選出甘露醇的最適濃度是6%～8%，在（16±2） ℃，1 000 lx，8 h·d-1光照條件下可以使試管苗保存時間延長至330 d（11個月），成活率達35%左右；當甘露醇濃度升高至10%時，試管苗的成活率雖是最高，但試管苗的葉片主要集中生長在植株頂部，不利于轉接且再生植株生長較緩慢。這是否是因為甘露醇的后效應還有待研究。

此外，辛淑英[9]報道用甘露醇保存過的甘薯試管苗一年后進行大田種植，發(fā)現(xiàn)低濃度甘露醇具有顯著的增產(chǎn)效果，高濃度甘露醇嚴重抑制甘薯塊根的生長，從而影響單株產(chǎn)量，即藥物濃度與產(chǎn)量呈負相關。本項目組篩選出的甘露醇適用濃度是否也存在類似情況，也是本項目研究人員后期要開展的研究內(nèi)容之一，以確保甘薯種質(zhì)遺傳性能最大限度地被完好保存下來。

參考文獻：

[1] 盧新雄，陳叔平，劉旭.農(nóng)作物種質(zhì)資源保存技術規(guī)程[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008.

[2]劉麗芳，陳曉玲，盧新雄，等.甘薯種質(zhì)超低溫保存技術研究進展[J].植物遺傳資源學報，2009，10（2）：324-327.

[3] 張海燕，張立明，王慶美，等.甘薯[Ipomoea batatas（L）Lam]試管苗種質(zhì)保存技術研究進展[J].雜糧作物，2005，25（1）：35-37.

[4] 張海燕，王慶美，張立明，等.多效唑?qū)Ω适碓嚬苊绶N質(zhì)保存的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2008（7）：33-34，37.

[5]張希太.應用多效唑常溫保存對甘薯試管種質(zhì)的研究[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2003，11（7）：41-44.

[6] 唐君，王意宏.試管苗保存甘薯種質(zhì)的效果[J].作物雜志，1996（4）：28-29.

[7] Templeton-somers K M，Collins W W.Field performance and clonal variability in sweet potatoes propagated in vitro[J].J Amer Soc Hort Sci，1986，111：689-694.

[8] 王意宏，唐君，郭小丁，等.甘薯（Ipomoea batatas Lam）試管保存苗遺傳穩(wěn)定性初探[C]//馬緣生.作物種質(zhì)資源保存研究論文集.北京：北京學術期刊出版社，1989：204-209.

[9] 幸淑英.甘薯（Ipomoea batatas Lam）種質(zhì)保存的技術和條件[C]//馬緣生.作物種質(zhì)資源保存研究論文集.北京：北京學術期刊出版社，1989：2-9.endprint

甘露醇對試管苗株高有抑制作用，并隨濃度的增高抑制效果越強。如表1所示，在對照中當試管苗培養(yǎng)90 d時即可達到最大高度8.12 cm，而在添加甘露醇的處理中試管苗的株高均未達到8 cm，特別是當甘露醇的使用濃度高于4%后，株高明顯受到抑制，當使用濃度為10%時，試管苗最大高度只有3.93 cm，比對照矮4.19 cm。說明低濃度（2%）甘露醇對所試材料試管苗株高抑制效果不是太明顯，而高濃度甘露醇（≥4%）可以明顯抑制試管苗生長高度；此外，甘露醇可延緩試管苗達到最大高度的時間，一般延長60～90 d。

2.2 甘露醇對試管苗葉片數(shù)的影響

如表1，在培養(yǎng)60 d時，各處理中試管苗能達到最高葉片數(shù)，但隨甘露醇濃度的增加，葉片數(shù)在降低。其中以對照中試管苗葉片數(shù)最高，是12.07片；其次是2%甘露醇處理；10%甘露醇處理中試管苗葉片數(shù)最低，只有6.56片，比對照低5.51。培養(yǎng)60 d后，隨培養(yǎng)時間的延長和培養(yǎng)基內(nèi)水分和營養(yǎng)成分的消耗，各處理中試管苗葉片會不同程度地發(fā)生變黃死亡，葉片數(shù)量有降低趨勢；但各處理中葉片數(shù)降低的速度不盡相同，對照中葉片數(shù)降低速度最快，在培養(yǎng)180 d時就為0；2%和4%甘露醇處理中葉片數(shù)在培養(yǎng)300 d和330 d時為0，分別比對照延長了120 d和150 d；6%，8%，10%甘露醇處理中試管苗到培養(yǎng)330 d時，葉片數(shù)仍能達到5片左右。說明甘露醇能延緩葉片的衰老，隨濃度的增加延緩的作用越強。

2.3 甘露醇對試管苗可用節(jié)數(shù)量的影響

甘露醇對試管苗可用節(jié)數(shù)量的形成有抑制作用，隨使用濃度的增加，抑制效果越明顯，對照中最高可用節(jié)數(shù)為7.31，而在10%甘露醇處理中的僅為2.04，低出對照5.27（表1）。在2%和4%甘露醇處理中，當試管苗培養(yǎng)240 d后，試管苗株高雖是7.50 cm和6.00 cm，但因葉片數(shù)急劇下降，并且集中著生在試管苗頂部，導致可用節(jié)數(shù)下降幅度明顯，只有1～2個。

2.4 甘露醇對試管苗成活率的影響

添加甘露醇可延緩試管苗衰老的速度（表1）。對照中試管苗培養(yǎng)90 d起就開始有葉片發(fā)黃死亡，植株枯死現(xiàn)象發(fā)生，而2%甘露醇處理中在180 d時才發(fā)生，比對照延長了90 d；高濃度甘露醇處理（≥4%）的至少比對照延長了120 d，高的達到150 d。

試管苗培養(yǎng)90 d后，在各濃度甘露醇處理中試管苗成活率在各個觀察期均高出對照，2%和4%處理中當試管苗培養(yǎng)300 d后才為0，比對照延長了120 d和150 d；6%～10%處理中試管苗在培養(yǎng)330 d時仍達到35%左右的成活率，此時的試管苗葉色綠，根尖和須根呈現(xiàn)白色，生長正常。但因10%處理上的試管苗葉片較集中在植株頂部，不利于轉接且不利于繼代培養(yǎng)，故篩選出6%～8%的甘露醇濃度較適于試管苗保存。

3 結論與討論

研究結果表明，培養(yǎng)基內(nèi)加入甘露醇可抑制甘薯試管苗的生長和延長試管苗保存時間，篩選出甘露醇的最適濃度是6%～8%，在（16±2） ℃，1 000 lx，8 h·d-1光照條件下可以使試管苗保存時間延長至330 d（11個月），成活率達35%左右；當甘露醇濃度升高至10%時，試管苗的成活率雖是最高，但試管苗的葉片主要集中生長在植株頂部，不利于轉接且再生植株生長較緩慢。這是否是因為甘露醇的后效應還有待研究。

此外，辛淑英[9]報道用甘露醇保存過的甘薯試管苗一年后進行大田種植，發(fā)現(xiàn)低濃度甘露醇具有顯著的增產(chǎn)效果，高濃度甘露醇嚴重抑制甘薯塊根的生長，從而影響單株產(chǎn)量，即藥物濃度與產(chǎn)量呈負相關。本項目組篩選出的甘露醇適用濃度是否也存在類似情況，也是本項目研究人員后期要開展的研究內(nèi)容之一，以確保甘薯種質(zhì)遺傳性能最大限度地被完好保存下來。

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[7] Templeton-somers K M，Collins W W.Field performance and clonal variability in sweet potatoes propagated in vitro[J].J Amer Soc Hort Sci，1986，111：689-694.

[8] 王意宏，唐君，郭小丁，等.甘薯（Ipomoea batatas Lam）試管保存苗遺傳穩(wěn)定性初探[C]//馬緣生.作物種質(zhì)資源保存研究論文集.北京：北京學術期刊出版社，1989：204-209.

[9] 幸淑英.甘薯（Ipomoea batatas Lam）種質(zhì)保存的技術和條件[C]//馬緣生.作物種質(zhì)資源保存研究論文集.北京：北京學術期刊出版社，1989：2-9.endprint

甘露醇對試管苗株高有抑制作用，并隨濃度的增高抑制效果越強。如表1所示，在對照中當試管苗培養(yǎng)90 d時即可達到最大高度8.12 cm，而在添加甘露醇的處理中試管苗的株高均未達到8 cm，特別是當甘露醇的使用濃度高于4%后，株高明顯受到抑制，當使用濃度為10%時，試管苗最大高度只有3.93 cm，比對照矮4.19 cm。說明低濃度（2%）甘露醇對所試材料試管苗株高抑制效果不是太明顯，而高濃度甘露醇（≥4%）可以明顯抑制試管苗生長高度；此外，甘露醇可延緩試管苗達到最大高度的時間，一般延長60～90 d。

2.2 甘露醇對試管苗葉片數(shù)的影響

如表1，在培養(yǎng)60 d時，各處理中試管苗能達到最高葉片數(shù)，但隨甘露醇濃度的增加，葉片數(shù)在降低。其中以對照中試管苗葉片數(shù)最高，是12.07片；其次是2%甘露醇處理；10%甘露醇處理中試管苗葉片數(shù)最低，只有6.56片，比對照低5.51。培養(yǎng)60 d后，隨培養(yǎng)時間的延長和培養(yǎng)基內(nèi)水分和營養(yǎng)成分的消耗，各處理中試管苗葉片會不同程度地發(fā)生變黃死亡，葉片數(shù)量有降低趨勢；但各處理中葉片數(shù)降低的速度不盡相同，對照中葉片數(shù)降低速度最快，在培養(yǎng)180 d時就為0；2%和4%甘露醇處理中葉片數(shù)在培養(yǎng)300 d和330 d時為0，分別比對照延長了120 d和150 d；6%，8%，10%甘露醇處理中試管苗到培養(yǎng)330 d時，葉片數(shù)仍能達到5片左右。說明甘露醇能延緩葉片的衰老，隨濃度的增加延緩的作用越強。

2.3 甘露醇對試管苗可用節(jié)數(shù)量的影響

甘露醇對試管苗可用節(jié)數(shù)量的形成有抑制作用，隨使用濃度的增加，抑制效果越明顯，對照中最高可用節(jié)數(shù)為7.31，而在10%甘露醇處理中的僅為2.04，低出對照5.27（表1）。在2%和4%甘露醇處理中，當試管苗培養(yǎng)240 d后，試管苗株高雖是7.50 cm和6.00 cm，但因葉片數(shù)急劇下降，并且集中著生在試管苗頂部，導致可用節(jié)數(shù)下降幅度明顯，只有1～2個。

2.4 甘露醇對試管苗成活率的影響

添加甘露醇可延緩試管苗衰老的速度（表1）。對照中試管苗培養(yǎng)90 d起就開始有葉片發(fā)黃死亡，植株枯死現(xiàn)象發(fā)生，而2%甘露醇處理中在180 d時才發(fā)生，比對照延長了90 d；高濃度甘露醇處理（≥4%）的至少比對照延長了120 d，高的達到150 d。

試管苗培養(yǎng)90 d后，在各濃度甘露醇處理中試管苗成活率在各個觀察期均高出對照，2%和4%處理中當試管苗培養(yǎng)300 d后才為0，比對照延長了120 d和150 d；6%～10%處理中試管苗在培養(yǎng)330 d時仍達到35%左右的成活率，此時的試管苗葉色綠，根尖和須根呈現(xiàn)白色，生長正常。但因10%處理上的試管苗葉片較集中在植株頂部，不利于轉接且不利于繼代培養(yǎng)，故篩選出6%～8%的甘露醇濃度較適于試管苗保存。

3 結論與討論

研究結果表明，培養(yǎng)基內(nèi)加入甘露醇可抑制甘薯試管苗的生長和延長試管苗保存時間，篩選出甘露醇的最適濃度是6%～8%，在（16±2） ℃，1 000 lx，8 h·d-1光照條件下可以使試管苗保存時間延長至330 d（11個月），成活率達35%左右；當甘露醇濃度升高至10%時，試管苗的成活率雖是最高，但試管苗的葉片主要集中生長在植株頂部，不利于轉接且再生植株生長較緩慢。這是否是因為甘露醇的后效應還有待研究。

此外，辛淑英[9]報道用甘露醇保存過的甘薯試管苗一年后進行大田種植，發(fā)現(xiàn)低濃度甘露醇具有顯著的增產(chǎn)效果，高濃度甘露醇嚴重抑制甘薯塊根的生長，從而影響單株產(chǎn)量，即藥物濃度與產(chǎn)量呈負相關。本項目組篩選出的甘露醇適用濃度是否也存在類似情況，也是本項目研究人員后期要開展的研究內(nèi)容之一，以確保甘薯種質(zhì)遺傳性能最大限度地被完好保存下來。

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