葛仙米多糖硫酸酯抗凝血活性研究

朱玉婷，袁 杰，楊 潔，田 瑞，曾 智，莫開菊*

(1．湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施445000;2．生物資源保護與利用湖北省重點實驗室( 湖北民族學(xué)院) ，湖北 恩施445000;3．湖北民族學(xué)院 附屬民大醫(yī)院，湖北 恩施445000)

多糖硫酸酯是一類糖鏈上帶有硫酸基的多糖，包括從各種植物或微生物中提取的天然多糖硫酸酯及人工合成的各種多糖硫酸酯．前人研究表明，多糖經(jīng)硫酸酯化后，其免疫力［1］、抗病毒［2］、抗凝血［3］、抗氧化［4］及抗腫瘤［5］等生物學(xué)活性都得到明顯的增強，使得硫酸酯化修飾多糖的研究成為多糖研究領(lǐng)域的熱點之一．

葛仙米，學(xué)名“擬球狀念珠藻”(Nostoc spharoidskütz)，屬藍藻門(Cyanopyhta)藍藻綱(Cyanohpyceae)段殖藻目(Hormogonales)念珠藻科(Nostocaceae)念珠藻屬(Nostoc)［6］，古名天仙米、天仙菜，俗稱水木耳［7］，與發(fā)菜(N． flagelliforme)、地木耳(Nostoc communeVanch)為同屬植物，其出現(xiàn)在螺旋藻(Spinclina)之前［8］．世界上葛仙米的分布非常稀少，我國主要分布在湖北省鶴峰縣的走馬坪鎮(zhèn)．另外，非洲等地也有少量的分布．葛仙米中水溶性多糖的提取率達到30%以上［9］．本試驗對葛仙米多糖進行硫酸酯化衍生，并對衍生前后的多糖硫酸酯的流變學(xué)特性及體外抗凝血活性進行探討，以期為葛仙米多糖資源的深度開發(fā)提供參考．

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

葛仙米多糖及其硫酸酯化產(chǎn)物的樣品(自制);血漿:正常人血(由湖北省恩施市湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院提供);APTT、PT、TT 檢測試劑盒(法國STAGO 原裝試劑盒，批號分別為107088、107541、107825);試驗使用的戊巴比妥、肝素鈉、枸櫞酸納及氯化鈉等試劑均為分析純．

1．2 主要儀器

電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);HH－6 數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司);真空干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);低速臺式離心機(上海安亭科技儀器廠);血小板及血凝測試儀(法國STAGO);血凝杯(天津普利生科技有限公司)．

1．3 硫酸酯化葛仙米多糖合成［10］

在V(氯磺酸)與V(吡啶)比例為1 ∶6、反應(yīng)溫度60℃、反應(yīng)時間5 h 的條件下，合成葛仙米多糖硫酸酯(DS=1．01)備用．

在V(氯磺酸)與V(吡啶)比例為1 ∶6、反應(yīng)溫度70℃、反應(yīng)時間7 h 的條件下，合成葛仙米多糖硫酸酯(DS=0．51)備用．

1．4 用于抗凝血試驗的葛仙米多糖及其硫酸酯化樣品的配制

用生理鹽水分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．2%的葛仙米多糖及其硫酸酯化樣品溶液，4℃保存?zhèn)溆茫囼灂r用生理鹽水稀釋至所需的質(zhì)量分?jǐn)?shù)．依照文獻并結(jié)合預(yù)試驗所得的結(jié)果，選用0、5、10、20、40 和80 μg/mL 共6個質(zhì)量體積比梯度，將肝素鈉配成質(zhì)量體積比為5．04 μg/mL 溶液備用．

1．5 血漿制備

取正常人的靜脈血，置于含有1/10 體積0．109 mol/L 枸椽酸鈉抗凝劑的塑料離心管中，輕輕顛倒混勻．在3 000 r/min 的條件下離心15 min，取上層貧血小板血漿，分裝至離心管中，－20℃冷凍保存?zhèn)溆?，使用時37℃孵育．注意血漿樣品不能有溶血現(xiàn)象，操作時盡量迅速，臨用時37℃恒溫水浴融化，5 h 測量相應(yīng)指標(biāo)．

1．6 抗凝血參數(shù)測定

按儀器使用說明將試劑和質(zhì)控物放入儀器后，儀器自動進行活化部分凝血活酶時間(activeted partial thromboplasting time，APTT)、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、凝血酶時間(thrombin time ，TT)三個項目的質(zhì)控分析，檢測數(shù)據(jù)在質(zhì)控允許范圍內(nèi)方可進行試驗，以確保其結(jié)果的準(zhǔn)確性．然后打開樣本抽屜，分別取不同取代度DS(DS=0，DS=0．51，DS=1．01)的葛仙米多糖硫酸酯(濃度分別為0、5、10、20、40、80 μg/mL)溶液0．1 mL 置于小玻璃試管中，然后向各管中加入50 uL 血漿，振蕩混勻編輯標(biāo)本序號，選擇APTT、PT、TT 檢測項目后按ENTER 鍵放入樣本抽屜，LED 燈亮后確認(rèn)位置和編號，儀器開始自動檢測．

2 結(jié)果分析與討論

2．1 活化部分凝血活酶時間(APTT)的測定

以肝素鈉為對照，將葛仙米多糖及其硫酸酯化產(chǎn)物分別進行活化部分凝血活酶時間測試，得到不同取代度及不同濃度產(chǎn)品對APTT 的影響，如圖1 所示．

圖1 葛仙米多糖及其硫酸酯化產(chǎn)物的部分凝血活酶時間(A:DS=0、B:DS=0．51、C:DS=1．01)Fig．1 APTT of native and sulfated Nostoc Sphaeroides Kützing Polysaccharide(A:DS=0、B:DS=0．51、C:DS=1．01)

由圖1 可知，肝素具有極強的延長APTT 的能力，當(dāng)其濃度增加到5．04 μg/mL 時APTT 是陰性對照(DS=0)的10 倍多，濃度再增加時APTT 超過了儀器的測量范圍，可視為血液不凝固．硫酸酯的取代度為1.01(DS=1．01)的樣品能顯著地延長活化部分凝血活酶時間，并隨著濃度的增大，其延長時間迅速增加．在濃度達到4 0μg/mL 時，其延長時間即達180 s 以上，表現(xiàn)出很強的抗凝活性．取代度為0．51(DS=0．51)的硫酸化樣品也表現(xiàn)出較強的抗凝血活性，但延長時間明顯小于取代度為1.01 的樣品．而葛仙米多糖原樣(DS=0)基本沒有表現(xiàn)出抗凝血活性．延長APTT 凝血時間的機理是樣品和內(nèi)源性凝血因子如Ⅻ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、PK、HMWK 和纖維蛋白原等相互作用，從而阻止血液凝固［11］．各樣品的凝血時間都隨著樣品的濃度增加而顯著增加，并且隨著硫酸酯取代度的增大其抗凝血活性也增加．由于硫酸基的引入改變了葛仙米多糖的化學(xué)組成和空間結(jié)構(gòu)，而導(dǎo)致對內(nèi)源性凝血因子作用強度的不同，因此表現(xiàn)出的凝血時間也不同．

2．2 血酶時間(TT)測定

以肝素鈉為對照，將葛仙米多糖及其硫酸酯化產(chǎn)物分別進行活化部分凝血活酶時間測試，得到不同取代度及不同濃度產(chǎn)品對TT 的影響，如圖2 所示．

圖2 葛仙米多糖及其硫酸酯化產(chǎn)物的凝血活酶時間(A:DS=0，B:DS=0．51、C:DS=1．01)Fig．2 TT of native and sulfated Nostoc Sphaeroides Kützing Polysaccharide(A:DS=0，B:DS=0．51、C:DS=1．01)

由圖2 可知，肝素具有極強的延長TT 的能力，當(dāng)其濃度增加到2．52 μg/mL 時APTT 是陰性對照(DS=0)的7 倍多，當(dāng)其濃度增加到5．04 μg/mL 時TT 超過了儀器的測量范圍，可視為血液不凝固．隨著葛仙米多糖硫酸酯濃度的增加，TT的凝血時間延長．在濃度為40 μg/mL 時，硫酸酯的取代度為1.01(DS=1．01)的樣品延長TT 時間即達203．9 s，是陰性對照的13 倍多;取代度為0.51(DS=0.51)的硫酸化樣品延長TT時間即達133 s，是陰性對照的8 倍多，明顯小于取代度為1.01 的抗凝血活性．在濃度為80 μg/mL 時，硫酸酯的取代度為1.01 和0．51 的硫酸酯化修飾物的凝血時間是陰性對照的12 倍多，與5．04 μg/mL 的肝素達到相同的效果．研究發(fā)現(xiàn)樣品對TT 的活性與樣品中硫酸酯的含量和糖含量的比值有關(guān)［11］，比值越大活性越強．TT 是檢測樣品對凝血酶活性以及血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白能力的過篩試驗［12－13］．TT 的延長說明葛仙米多糖硫酸酯能抑制凝血酶和纖維蛋白的聚合．

2．3 凝血酶原時間(PT)測定

以肝素鈉為對照，將葛仙米多糖及其硫酸酯化產(chǎn)物分別進行活化部分凝血活酶時間測試，得到不同取代度及不同濃度產(chǎn)品對PT 的影響，如圖3 所示．

圖3 葛仙米多糖及其硫酸酯化產(chǎn)物的凝血活酶原時間(A:DS=0，B:DS=0．51、C:DS=1．01)Fig．3 PT of native and sulfated Nostoc Sphaeroides Kützing Polysaccharide(A:DS=0，B:DS=0．51、C:DS=1．01)

PT 測定是檢測外源凝血系統(tǒng)較為理想和常用的篩選實驗．外源性凝血系統(tǒng)又稱組織系統(tǒng)凝血，是受傷的組織釋放凝血因子Ⅲ，進入血漿，與因子Ⅶ和Ca2+結(jié)合形成復(fù)合物，可催化因子X 變成活化因子X(Xa)．Xa、V、Ca2+及血小板磷脂共同形成凝血酶原激活物，從而使血液凝固．圖3 的試驗結(jié)果表明:葛仙米多糖及其硫酸酯化產(chǎn)物都沒有顯著延長PT 時間的效果，這和文獻中關(guān)于肝素和其他多糖硫酸酯樣品類似．Nishio 等［12］研究表明從昆布中提取的褐藻多糖硫酸酯對PT的影響很小．本試驗結(jié)果顯示葛仙米多糖及其硫酸酯化產(chǎn)物，未影響到外源凝血過程中的任何階段，即對外源凝血途徑作用不明顯，說明它和肝素具有相似的抗凝血機制．

3 結(jié)論

葛仙米多糖本身沒有抗凝血活性，而其硫酸酯化產(chǎn)物則具有抗凝血活性．隨著硫酸酯取代度的增大，APTT 和TT 也隨之延長，并有量效關(guān)系，但對PT 的作用不明顯．說明其主要是通過抑制內(nèi)源性凝血過程及共同凝血途徑發(fā)揮抗凝血作用，對外源凝血途徑影響較弱．

［1］ 楊鐵虹，賈敏，商澎，等．當(dāng)歸多糖硫酸酯的合成及其對脾細(xì)胞增殖的作用［J］．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2001，22(5):432－434．

［2］ 辛現(xiàn)良，丁華，耿美玉，等．海洋硫酸多糖911 抗艾滋病毒作用及其機理研究－體內(nèi)對猴免疫缺陷病毒(SIV)增殖的影響［J］．中國海洋藥物雜志，2000，19(6):4－8．

［3］ 程忠玲．海帶中褐藻多糖硫酸酯的提取及抗凝血活性的測試［J］．承德石油高等?？茖W(xué)校學(xué)報，2003，5(3):27－30．

［4］ 薛長湖，陳磊，李兆杰，等．巖藻聚糖硫酸酯體外抗氧化特性的研究［J］．青島海洋大學(xué)學(xué)報，2000，30(4):583－588．

［5］ Yamamoto I，Nagumo T，Takahashi M，et al．Antitumor effect of seaweeds． III． Antitumor effect of an extract from Sargassum kjellmanianum［J］．Japan Journal of Experimental Medicine，1981，51(3):187－189．

［6］ 朱浩然．中國淡水藻志［M］．2 卷．北京:科學(xué)出版社，1991:1－10．

［7］ 丁廣奇，王學(xué)文．植物學(xué)名解釋［M］．北京:科學(xué)出版社，1986:452－463．

［8］ 尤崇杓．生物固氮［M］．北京:科學(xué)出版社，1987:159－192．

［9］ 莫開菊，周志，汪興平，等．堿液和木瓜蛋白酶預(yù)處理對葛仙米多糖提取效果的影響［J］．食品科學(xué)，2007，28(11):194－197．

［10］ 朱玉婷，譚姚，莫開菊．硫酸酯化修飾葛仙米多糖工藝研究［J］．食品科學(xué)，2011，32(24):46－49．

［11］ Melo F R，Pereira M S，F(xiàn)oguel D，et al．Antithrombin－mediated anticoagulant activity of sulfated polysaeeharides－different mechanisms for heparin and sulfated galactans［J］．Journal of Biological Chemistry，2004，279(20):20824－20835．

［12］ Nishino T，Nagumo T．The sulfate－content dependence of the anticoagulant activity of a faun sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome［J］．Carbohydrate Research，1991，214(l):193－197．

［13］ Matsubara K，Mori M，Mstsumoto H，et al．Antieoagulant properties of a sulfated galactan isolated from a marine green alga，Codium cylindricum［J］．Journal of Applied phycology，2001，28(5):395－399．