不同菌劑處理對玉米芯發(fā)酵過程中纖維素降解及相關酶活性的影響

鮮開梅

（新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)技農(nóng)業(yè)技術推廣總站，烏魯木齊，830049）

育苗基質(zhì)是能為幼苗提供穩(wěn)定協(xié)調(diào)的水、氣、肥、結構的生長介質(zhì)，是無土育苗的重要組成部分。大量被拋棄或燃燒的廢棄物經(jīng)過一定加工處理后可作為良好的環(huán)保型無土栽培有機基質(zhì)。近年來，科研工作者利用各種農(nóng)業(yè)副產(chǎn)有機物及某些廢棄物研制合成了成本低、資源豐富、可再生的環(huán)保型無土栽培有機基質(zhì)，在各園藝作物上栽培應用效果良好。

目前有機廢棄物的有效利用主要通進行高溫好氧堆肥化處理，使堆肥原料中的不穩(wěn)定有機物形成性質(zhì)穩(wěn)定、對農(nóng)作物無害的堆肥產(chǎn)品。但堆肥速度與質(zhì)量依基質(zhì)種類、發(fā)酵條件（發(fā)酵微生物、基質(zhì)C/N比、含水、氧量等）而不同，其中微生物菌劑與菌種的選擇是關系堆肥速度與質(zhì)量的重要因素。

傳統(tǒng)秸稈堆肥通常都是采用改善環(huán)境條件或增加營養(yǎng)的方法，往往存在發(fā)酵時間長、有臭味且肥效低等問題[1，2]，而且作物秸稈中含有大量成分復雜、難以被充分利用或被大多數(shù)微生物直接作為碳源物質(zhì)而轉(zhuǎn)化利用的木質(zhì)纖維素[3]。在發(fā)酵過程中，降解由易到難依次為：粗脂肪和碳水化合物＞纖維素和半纖維素＞木質(zhì)素。如何提高它們的分解速率、縮短發(fā)酵周期、提高降解率、得到穩(wěn)定的發(fā)酵產(chǎn)物是目前研究的難點；木質(zhì)纖維素的生物降解成為生物技術處理作物秸稈的關鍵，也是近年的研究重點。

目前研究表明[4～6]，采用接種微生物菌劑或有效菌種處理秸稈堆肥，明顯地促進了堆肥反應進程。陳華癸[7]教授曾指出，在堆肥過程中，進行人為接種分解有機物能力強的微生物，可加速堆肥材料的腐熟，且形成利于消滅某些病原體、蟲卵和雜草種子的高溫。秸稈堆肥發(fā)酵過程中，目前有采用單一菌株作為發(fā)酵劑的方法，也有采用高效復合菌劑作為發(fā)酵劑。此外，在堆肥發(fā)酵過程中加入木質(zhì)素分解菌以促進木質(zhì)素這類難降解有機物質(zhì)的分解，可有效縮短發(fā)酵時間，提高堆肥處理效果。

玉米芯是玉米的副產(chǎn)品，新疆地區(qū)玉米資源豐富，每年經(jīng)過脫粒下的玉米芯，倘若經(jīng)過腐熟堆肥化作用后作為無土栽培基質(zhì)，對資源的綜合利用和地方經(jīng)濟的發(fā)展有很大的促進作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2013年3月5日至12月10日在石河子大學農(nóng)學院試驗站設施溫室內(nèi)進行。以玉米芯為材料。試驗采用的3種市售微生物菌劑分別是：EM酵素菌（購于河南磐龍酵素菌生物工程有限公司）；有機物料腐熟劑（購于北京世紀阿姆斯生物技術有限公司）；金寶貝菌劑（購于北京華夏康源科技有限公司）。

1.2 試驗方法與處理

試驗采用堆肥化腐熟處理，堆置前將玉米芯粉碎至0.3～0.5 cm，玉米芯添加羊糞、尿素以及水等配料，調(diào)配至適宜的C/N比（30∶1）及控制總物料含水量為50%～60%，將預培養(yǎng)的菌劑均勻地與玉米芯基質(zhì)充分混合。試驗共設置4個處理，詳見表1，以不添加發(fā)酵菌劑的處理為對照（CK）。隨機區(qū)組設計，重復3次。堆體體積約直徑1.5 m，高0.8 m，堆體上覆蓋塑料薄膜進行發(fā)酵。堆肥發(fā)酵期間每天14：00觀察堆體溫度，待堆體溫度達到65℃左右時，及時翻堆并調(diào)整水分含量在50%～60%。在試驗期間共取樣 4 次，依次為發(fā)酵后 0，10，20，30 d，取各處理堆體中心部位處基質(zhì)100 g作為樣品，帶回實驗室使其自行風干后進行理化性質(zhì)的測定。待堆體溫度與環(huán)境溫度基本一致、發(fā)酵物料變成深褐色、無惡臭味時結束。

1.3 測定內(nèi)容及方法

①纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量的測定 發(fā)酵結束后取發(fā)酵樣品烘干至恒重，參考賀明娟等[8]的方法分析其中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量，結合初始發(fā)酵物料中各纖維類組分的含量，分別計算纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率。

②酶液提取 隔5 d取2.0 g發(fā)酵的固體基質(zhì)，用12 mL雙蒸水于4°C浸提甘草渣固體培養(yǎng)物過夜，200 r/min振蕩提取1 h，轉(zhuǎn)移提取液；再用4 mL雙蒸水，于200 r/min振蕩提取15 min，重復一次，完全轉(zhuǎn)移、合并提取液，4°C保存待測酶活性。

③酶活性測定 a.木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）活力測定。取0.2 mL藜蘆醇溶液（10 mmol/L）、0.4 mL酒石酸緩沖液（250 mmol/L，pH值3.0）與0.4 mL粗酶液混勻，即得1 mL反應液。在30℃下，往此反應液中加20 μL H2O2溶液 （20 mmol/L） 啟動酶促反應，并在310 nm波長下測定反應1 min前后的反應液吸光度變化。一個酶活力單位（U）定義為每1 min氧化藜蘆醇產(chǎn)生1 μmol藜蘆醛所需的酶量。

b.漆酶（Lac）活力的測定。采用ABTS法，反應液在30℃保溫3 min，后在波長420 nm處測定吸光值的增加。將在100℃煮沸15 min的酶液作為陰性對照。酶活力單位定義為反應體系中每1 min引起0.1個吸光度增加所需的酶量。

c.纖維素酶（FP）活力的測定。取0.5 mL的酶液，加入1 mL 1%CMC-Na溶液，混勻，50℃水浴15 min，加入2 mL DNS煮沸 10 min，流水冷卻，加蒸餾水定容至10 mL，混勻，測OD540值。對照：在0.5 mL稀釋酶液加入1 mL 1%CMC-Na溶液，再加入2 mL DNS煮沸10 min，流水冷卻，加蒸餾水定容至10 mL，混勻，測OD540值。酶活力定義為每1 min產(chǎn)生1 μmol的葡萄糖的酶量為一個酶活力單位。

d.羥甲基纖維素酶（CMC）、木聚糖酶活性測定。采用DNS法。

表1 不同發(fā)酵菌劑的試驗處理

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)取平均值，采用 Excel 2003和DPS 7.5軟件進行處理，并進行Duncan's多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同菌種處理下玉米芯基質(zhì)發(fā)酵過程中纖維素、半纖維素降解率的變化

①纖維素降解率 由圖1可知，經(jīng)過30 d的發(fā)酵培養(yǎng)，3種不同菌種處理下的玉米芯基質(zhì)發(fā)酵過程中的纖維素均有不同程度降解。在發(fā)酵10 d測得，T1、T2和T3的纖維素降解率為12.3%、15.8%和 15.4%，分別比對照的 12.1%高 1.7%、30.6%和25.6%，T2和T3與對照相比差異顯著。在發(fā)酵20 d測得，T1、T2和T3的纖維素降解率為26.6%、25.7%和23.7%，分別比對照的18.6%高43.0%、38.2%和 37.6%，T1、T2和T3與對照相比差異顯著，T1和T2之間無顯著差異。在發(fā)酵30 d測得，T1、T2和 T3的纖維素降解率為 44.4%、34.4%和36.3%，分別比對照的24.9%高78.30%、38.2%和45.8%，T1、T2和T3與對照相比差異顯著，T2和T3之間無顯著差異。說明3種菌種處理可有效地提高玉米芯基質(zhì)的纖維素降解率，T1效果最佳。

②半纖維素降解率 從圖2可看出，半纖維素隨發(fā)酵時間的延長降解趨勢與纖維素一致。經(jīng)過30 d的發(fā)酵培養(yǎng)，3種不同菌種處理下的玉米芯基質(zhì)發(fā)酵過程中的半纖維素均有不同程度的降解。在發(fā)酵10 d測得，T1、T2和T3的半纖維素降解率為24.3%、20.0%和 23.1%，分別比對照的13.8%高76.1%、44.9%和 67.4%，T1、T2和 T3與對照相比差異顯著，T1和T3間無顯著差異，但與T2差異顯著。在發(fā)酵20 d測得，T1、T2和T3的半纖維素降解率為35.3%、28.5%和34.5%，分別比對照的23.3%高51.5%、22.3%和48.1%，T1、T2和T3與對照相比差異顯著，T1和T3之間無顯著差異，但與T2差異顯著。在發(fā)酵30 d測得，T1、T2和T3的半纖維素降解率為48.9%、43.9%和42.1%，分別比對照的35.8%高36.6%、22.6%和17.6%，T1、T2和T3與對照相比差異顯著，T2和T3之間無顯著差異，但與T1達到顯著差異。說明3種菌種處理均可有效提高玉米芯基質(zhì)的半纖維素降解率，其中T1效果最佳。

2.2 不同菌種處理下玉米芯基質(zhì)發(fā)酵過程中木質(zhì)素降解率的變化

由圖3可知，3種不同菌種處理下的玉米芯基質(zhì)發(fā)酵過程中的木質(zhì)素均有不同程度的降解。在發(fā)酵 10 d測得，T1、T2和 T3的木質(zhì)素降解率為12.2%、12.4%和15.9%，分別比對照的11.1%高9.9%、10.9%和43.2%，T1和T2與對照相比無顯著差異，T3與對照之間差異顯著。在發(fā)酵20 d測得，T1、T2和 T3的木質(zhì)素降解率為 16.0%、18.3%和25.1%，分別比對照的 15.2%高 5.3%、20.4%和65.1%，T1與對照相比無明顯差異，T1、T2和T3之間差異顯著。在發(fā)酵30 d測得，T1、T2和T3的木質(zhì)素降解率為25.1%、24.6%和29.5%，分別比對照的19.6%高 28.1%、25.5%和 50.5%，T1、T2和 T3與對照相比差異顯著，T1、T2和T3之間差異顯著。說明3種菌種處理均可有效提高玉米芯基質(zhì)的木質(zhì)素降解率，其中T3效果最佳，T1次之。

2.3 不同菌種處理下玉米芯基質(zhì)發(fā)酵過程中纖維素降解酶活性的變化

①纖維素酶 從圖4可以看出，纖維素酶活性表現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在0～10 d的時間，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，纖維素酶活性逐漸增強，在發(fā)酵10 d后測得3種添加菌劑的玉米芯基質(zhì)中的纖維素酶活性均高于對照，T1活性最強，與對照相比提高36.1%，與其他各處理之間差異明顯，且T1的纖維素酶活性在發(fā)酵10 d時表現(xiàn)為峰值，為7.2 U/L，其他各處理均在20 d時出現(xiàn)峰值，之后隨著發(fā)酵時間的延長，纖維素酶活性開始緩慢降低，發(fā)酵30 d測得各處理之間無明顯差異。

②羥甲基纖維素酶 從圖5可以看出，羥甲基纖維素酶活性表現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在0～10 d，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，羥甲基纖維素酶活性逐漸增強，在發(fā)酵10 d后測得3種添加菌劑的玉米芯基質(zhì)中的羥甲基纖維素酶活性均高于對照，T1活性最強，與對照相比提高26.3%，與其他各處理之間差異明顯。T1和T2的羥甲基纖維素酶活性在發(fā)酵10 d時表現(xiàn)為峰值，分別為227.7 U/L和179.6 U/L。T3和CK處理均在20 d時出現(xiàn)峰值，之后隨著發(fā)酵時間的延長，羥甲基纖維素酶活性開始迅速降低，發(fā)酵30 d測得各處理的羥甲基纖維素酶活性表現(xiàn)為最低，各處理之間無明顯差異。

圖1 纖維素降解率的變化

圖2 半纖維素降解率的變化

圖3 木質(zhì)素降解率的變化

圖4 纖維素酶活性的變化

2.4 不同菌種處理下玉米芯基質(zhì)發(fā)酵過程中木質(zhì)素降解酶活性的變化

①木質(zhì)素過氧化物酶 從圖6可以看出，在0～30 d，除對照的木質(zhì)素過氧化物酶活性變化不明顯外，各發(fā)酵處理木質(zhì)素過氧化物酶活性表現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在0～10 d，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，各處理木質(zhì)素過氧化物酶活性逐漸增強，在發(fā)酵10 d后測得3種添加菌劑的玉米芯基質(zhì)中的木質(zhì)素過氧化物酶活性均高于對照，T1、T2和T3分別較對照提高125.4%、50.1%和175.1%。T3活性最強，在發(fā)酵20 d后達到峰值，與對照相比提高362.5%，且與其他各處理間差異明顯，之后迅速下降，在發(fā)酵30 d后測得的木質(zhì)素過氧化物酶活性仍高于其他各處理，且差異明顯，T1和T2與對照之間無明顯差異。

②漆酶 如圖7所示，在整個試驗過程中對照和各處理漆酶活性表現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在0～20 d，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，漆酶活性逐漸增強，在0～10 d增加迅速，之后T3的漆酶活性仍保持較高速度的增長，在發(fā)酵20 d時CK、T1和T3的漆酶活性均達到最大值，測得3種添加菌劑的玉米芯基質(zhì)中的漆酶活性均高于對照，T3活性明顯高于CK、T1和T2。之后隨著發(fā)酵時間的延長，漆酶活性開始急劇降低，發(fā)酵30 d測得T3處理漆酶活性高于其他各處理，但各處理之間無明顯差異。

2.5 不同菌種處理下玉米芯基質(zhì)發(fā)酵過程中木聚糖酶活性的變化

從圖8中可以看出，木聚糖酶活性表現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在0～20 d，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，木聚糖酶活性逐漸增強，在發(fā)酵20 d后急劇下降，在試驗過程中，測得3種添加菌劑的玉米芯基質(zhì)中的木聚糖酶活性與對照差異均不明顯。且各處理的木聚糖酶活性在發(fā)酵20 d時表現(xiàn)為峰值，之后隨著發(fā)酵時間的延長，木聚糖酶活性開始急劇下降，發(fā)酵30 d測得T1的木聚糖酶活性表現(xiàn)為最低。

3 結論與討論

本試驗研究結果表明，不同發(fā)酵菌劑處理下，玉米芯中半纖維素的降解率普遍高于纖維素的降解率，說明所用菌種（劑）對半纖維素都具有較強的降解能力，玉米芯中半纖維素比較容易降解。

本研究結果表明，經(jīng)過30 d的發(fā)酵培養(yǎng)，3種不同菌種處理下的玉米芯基質(zhì)發(fā)酵過程中的纖維素均有不同程度的降解，說明3種菌種處理可有效的提高玉米芯基質(zhì)的纖維素降解率，其中T1效果最佳。同時，3種菌種處理也均可有效地提高玉米芯基質(zhì)的木質(zhì)素降解率，其中T3效果最佳，T1次之。研究結果表明，通過利用木質(zhì)素優(yōu)良降解菌和纖維素優(yōu)良降解菌混合發(fā)酵降解木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解工藝是可行的，有一定的實用性。這種共降解工藝為甘草渣的生物降解提供了一種新途徑。同時利用市場上現(xiàn)售菌劑對玉米芯進行降解，也具有一定的實用性，加快了玉米芯發(fā)酵進程，縮短了發(fā)酵時間。

圖5 羥甲基纖維素酶活性的變化

圖6 木質(zhì)素過氧化物酶活性的變化

圖7 漆酶活性的變化

圖8 木聚糖酶活性的變化

真菌分解木質(zhì)素主要是依靠一個復雜的胞外過氧化酶系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要由木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin Peroxidase/LiP）、錳過氧化物酶（Manganases Peroxidase/MnP）和漆酶（Laccase/Lac）3 種酶構成。白腐菌是少數(shù)的能選擇性降解木質(zhì)素的真菌之一，它們通過分泌木質(zhì)素降解酶系的主要成分等胞外氧化酶來降解木質(zhì)素。在3種不同處理下的發(fā)酵過程中分別取樣進行木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶的測定，結果表明，在0～30 d的發(fā)酵時間內(nèi)，除對照的木質(zhì)素過氧化物酶活性變化不明顯外，各發(fā)酵處理木質(zhì)素過氧化物酶活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢；在發(fā)酵10 d后測得3種添加菌劑的玉米芯基質(zhì)中的木質(zhì)素過氧化物酶活性均高于對照；在整個測定過程中對照和各處理漆酶活性表現(xiàn)先升高后降低的趨勢，發(fā)酵30 d測得T3處理漆酶活性高于其他各處理，但各處理之間無顯著差異。以上結果說明，在玉米芯發(fā)酵過程中，金寶貝微生物菌劑能促進基質(zhì)中木質(zhì)素過氧化物酶活性和漆酶活性的增強，促進基質(zhì)腐熟，使有機物料釋放大量的養(yǎng)分。

木聚糖是植物細胞的一種主要的結構多糖，是自然界含量位居第2位的多糖，占地球上約1/3的可再生有機碳源，是半纖維素的主要成分，木聚糖酶是一類水解酶，可以將木聚糖降解成低聚木糖和木糖。本研究結果表明，在0～30 d的發(fā)酵過程中，木聚糖酶活性表現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在0～20 d，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，木聚糖酶活性逐漸增強，在發(fā)酵20 d后急劇下降，測得3種添加菌劑的玉米芯基質(zhì)中的木聚糖酶活性與對照無明顯差異。

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