肉豆蔻揮發(fā)油體外抗病原微生物活性研究＊

胡 杰，代 娟，王城城，陳玉平，唐婉林，代 敏，萬(wàn) 莉

成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院（成都 610500）

肉豆蔻具有溫中行氣、澀腸止瀉之功效，用于脾胃虛寒、久瀉不止、脘腹脹痛和食少嘔吐［1］，在蒙藥中主治心赫依、心刺痛、譫語(yǔ)、暈厥和心慌等諸多心臟疾?。?］?，F(xiàn)代研究［2］表明，肉豆蔻的化學(xué)成分主要包括揮發(fā)油、脂肪油、苯丙素、木脂素和黃酮等藥理活性成分，具有抗感染、抗氧化、鎮(zhèn)痛、止瀉、抗血栓、抗細(xì)胞凋亡、降血脂、抗血小板聚集、抗?jié)?、抗心律失常、抗腫瘤、壯陽(yáng)等廣泛的藥理活性［2－7］。

目前，關(guān)于肉豆蔻的抗細(xì)菌活性研究較多，既有肉桂水提物、甲醇、乙醇提取物和肉豆蔻揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性研究［8－11］，亦有單體成分的抗細(xì)菌活性研究［4］，如肉豆蔻氯仿萃取物中分離的三肉豆蔻酸甘油酯、肉豆蔻酸、甘油十四酸酯［12］，以及甲醇提取物中分離的肉豆蔻木酚素等。但這些研究都側(cè)重于定性分析，鮮有定量分析，難以有效比較不同研究的結(jié)果。對(duì)于肉豆蔻抗真菌活性研究報(bào)道較少，僅有肉豆蔻揮發(fā)油抗青霉、黑曲霉、黃曲霉、產(chǎn)黃青霉、根霉［13－14］，以及甲醇提取物中分離的肉豆蔻木酚素抑制植物病原真菌［15］的研究報(bào)道，未見(jiàn)有肉豆蔻抗白假絲酵母菌真菌活性的研究報(bào)道?；诖耍狙芯繑M對(duì)肉豆蔻主要活性部位揮發(fā)油抗臨床分離細(xì)菌和白假絲酵母菌真菌的抑菌活性進(jìn)行定量比較研究，為后續(xù)肉豆蔻在抗感染性疾病中的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物

肉豆蔻購(gòu)自成都同仁堂，水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)油，揮發(fā)油的提取方法參考文獻(xiàn)［1］。

1.2 菌種

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)株 1）細(xì)菌：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC43300，購(gòu)自美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心；大腸埃希菌 ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923由四川抗菌素工業(yè)研究所贈(zèng)送；大腸埃希菌CMCC（B）44102、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003購(gòu)自四川省食品藥品檢驗(yàn)所。2）白假絲酵母菌：白假絲酵母菌ATCC14053，購(gòu)自美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心；白假絲酵母菌CICC32819、白假絲酵母菌CICC1284，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2.2 臨床分離株 1）細(xì)菌：分離于四川省婦幼保健院和成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診患者，共16種67株（表1）。2）白假絲酵母菌：分離于四川省婦幼保健院門診患者，并經(jīng)BIO－KONT公司的KC－16鑒定板條與藥敏紙片鑒定，共14株（表2）。

1.3 培養(yǎng)基、試劑及耗材

沙氏瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），Mueller－Hinton agar（MH 瓊脂），營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）等。

1.4 主要儀器

VITEK DENSICHEK（法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)），多點(diǎn)接種儀（SAKUMA MIT－P型，日本佐久間生產(chǎn)），CO2INCUBATOR（MOC－15A）等。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)［16］，采用瓊脂平板2倍稀釋法測(cè)定肉豆蔻油對(duì)細(xì)菌和真菌的最低抑菌濃度（MIC）。

1.5.1 含藥平板制備 采用倍比稀釋法，用1%吐溫－80溶液把藥物稀釋成13個(gè)梯度，在無(wú)菌培養(yǎng)皿中分別加入14mL滅菌的MH瓊脂或沙氏瓊脂，以及1mL不同濃度梯度的稀釋藥液，充分混勻，制備不同濃度梯度的含藥平板，自然干燥后備用。平板內(nèi)分別以1%吐溫－80溶液和1mL無(wú)菌蒸餾水代替藥物制備溶劑對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照平板。

1.5.2 菌液制備 將實(shí)驗(yàn)菌株用無(wú)菌生理鹽水調(diào)至菌液濃度1.5×106CFU／mL。

1.5.3 MIC測(cè)定 用多點(diǎn)接種儀將受試菌液加入含藥平板和對(duì)照平板，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，觀察菌株生長(zhǎng)情況。以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)平板內(nèi)藥物的最小濃度為肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)該菌株的MIC。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析法統(tǒng)計(jì)分析肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)不同種屬菌株抑菌活性的強(qiáng)弱，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4株以上同種屬菌株，分析藥物抑制其50%和90%菌株的MIC，即 MIC50和 MIC90。

2 結(jié)果分析

2.1 肉豆蔻揮發(fā)油體外抗細(xì)菌活性

瓊脂平板2倍稀釋法測(cè)定肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌等16種細(xì)菌的MIC，結(jié)果表明肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)不同種類的細(xì)菌有不同程度的抑制作用，其中對(duì)表皮葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)，MIC為0.07～0.13mg／mL；對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性最差，MIC為4.25～8.50mg／mL；對(duì)其余受試菌株呈中等程度抑菌活性，MIC主要集中于0.27～1.06mg／mL（表1）。

表1 肉豆蔻揮發(fā)油的體外抗細(xì)菌活性

2.2 肉豆蔻揮發(fā)油體外抗真菌活性

瓊脂平板2倍稀釋法測(cè)定肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)白假絲酵母菌和非白假絲酵母菌臨床分離株的體外抑菌活性，結(jié)果表明肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)白假絲酵母菌（MIC為0.07～0.53mg／mL）和非白假絲酵母菌（MIC為0.07mg／mL）具有較強(qiáng)的體外抑菌活性，說(shuō)明肉豆蔻揮發(fā)油具有明顯的體外抗真菌活性（表2）。

表2 肉豆蔻揮發(fā)油的體外抗真菌活性

2.3 肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)不同種類病原微生物的抑菌活性比較

采用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析法統(tǒng)計(jì)肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)4株以上受試菌種的抑菌活性強(qiáng)弱，并比較MIC50和MIC90。結(jié)果表明：肉豆蔻揮發(fā)油抗真菌活性總體強(qiáng)于抗細(xì)菌活性，其中對(duì)白假絲酵母菌真菌的抑菌活性明顯強(qiáng)于金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌（P＜0.01）；肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)肺炎克雷伯菌和洛菲不動(dòng)桿菌的抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)肺炎克雷伯菌的MIC明顯低于金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌（P＜0.01，P＜0.05），且對(duì)肺炎克雷伯菌的MIC50（0.27mg／mL）和 MIC90（0.27～0.53mg／mL）均明顯小于對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的MIC50和 MIC90（表3）。

表3 肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)不同種類細(xì)菌和真菌的抑菌活性比較（mg／mL）

3 討論

肉豆蔻始載于唐《本草拾遺》，是一種傳統(tǒng)中蒙藥，兼有藥用和香料價(jià)值。目前主要研究其揮發(fā)油的藥理活性與化學(xué)成分，但由于提取方法與藥材來(lái)源不同，揮發(fā)油的化學(xué)成分差異明顯［2，9，16］。目前，關(guān)于其抑菌活性的研究報(bào)道較多，肉豆蔻水提物、甲醇提取物 、乙醇提取物和揮發(fā)油［8－11，15］以及肉豆蔻氯仿萃取物中分離的三肉豆蔻酸甘油酯、肉豆蔻酸、甘油十四酸酯［12］和肉豆蔻甲醇提取物中分離的肉豆蔻木酚素［4］均有一定程度的抑菌活性，但多數(shù)為定性分析，少有定量研究。本研究采用瓊脂平板2倍稀釋法定量測(cè)定了水蒸汽蒸餾提取的肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)臨床分離的4種革蘭陽(yáng)性菌和12種革蘭陰性菌的MIC，結(jié)果表明肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)所有受試菌有廣譜抗細(xì)菌活性，MIC為0.07～8.50mg／mL，其中對(duì)表皮葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)，MIC為0.07～0.13mg／mL；對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性最差，MIC為4.25～8.50mg／mL，與鄭國(guó)平等［14］報(bào)道“肉豆蔻精油對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和葡萄球菌的 MIC為2.5%～5%”的結(jié)果差異較大，分析原因可能是藥材來(lái)源和所用抑菌試驗(yàn)方法不同。關(guān)于肉豆蔻揮發(fā)油的抗真菌活性研究報(bào)道較少，謝小梅等［13］報(bào)道，肉豆蔻水提液對(duì)霉菌無(wú)抑菌活性，而肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)桔青霉、黑曲霉、黃曲霉、產(chǎn)黃青霉、黑根霉的 MIC和最低殺菌濃度（MFC）分別為 0.007% ～0.125% 和 0.031% ～0.125%；鄭國(guó)平等［14］報(bào)道，肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)根霉和青霉的MIC均為10%；肉豆蔻甲醇提取物中分離的肉豆蔻木酚素具有明顯抗植物病原真菌活性［15］。對(duì)于肉豆蔻揮發(fā)油抗白假絲酵母菌真菌活性，目前尚未見(jiàn)有報(bào)道。白假絲酵母菌可侵犯人體許多部位，是人體重要的條件致病性真菌之一，可引起皮膚、黏膜、內(nèi)臟及中樞神經(jīng)的念珠菌病。本實(shí)驗(yàn)首次分析了肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)白假絲酵母菌和非白假絲酵母菌臨床分離株的抑菌活性，結(jié)果表明，肉豆蔻揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗真菌活性，其中對(duì)白假絲酵母菌和非白假絲酵母菌 MIC分別為0.07～0.53mg／mL和0.07mg／mL，說(shuō)明可用于真菌與細(xì)菌所導(dǎo)致的各類感染性疾病。

本研究首次用單因素方差分析比較肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、洛菲不動(dòng)桿菌和白假絲酵母菌的抑菌活性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)白假絲酵母菌的抑菌活性［MIC（0.28±0.19）mg／mL］明顯強(qiáng)于對(duì)大腸埃希菌［MIC（0.79±0.32）mg／mL］和金黃色葡萄球菌［MIC為（0.63±0.28）mg／mL］的抑菌活性（P＜0.01），而與對(duì)肺炎克雷伯菌和洛菲不動(dòng)桿菌的抑菌活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。通過(guò)分析其對(duì)不同種類細(xì)菌的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，肉豆蔻揮發(fā)油僅對(duì)肺炎克雷伯菌的抑菌活性明顯強(qiáng)于金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌（P＜0.05，P＜0.01），對(duì)其它各菌種的抑菌活性與金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

本研究在受試細(xì)菌中既選擇了敏感臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株，又選擇了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氨芐青酶和超廣譜β－內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌等多重耐藥臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株。比較肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)敏感株和耐藥株的抗細(xì)菌和抗真菌活性，發(fā)現(xiàn)肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)敏感株和耐藥株的抗細(xì)菌和抗真菌活性無(wú)明顯差異，說(shuō)明肉豆蔻揮發(fā)油較化學(xué)合成藥物治療感染性疾病優(yōu)勢(shì)明顯。

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