ELISA試劑盒在奶牛早期妊娠檢測(cè)中的應(yīng)用

雷莉輝 孫 健 于鳳芝 （北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 北京 房山 102442）

ELISA試劑盒在奶牛早期妊娠檢測(cè)中的應(yīng)用

雷莉輝 孫 健 于鳳芝 （北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 北京 房山 102442）

準(zhǔn)確、快速、操作便捷的奶牛早期妊娠診斷技術(shù)是規(guī)模化奶牛場(chǎng)提高繁殖效率和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的重要手段。本試驗(yàn)通過(guò)采用ELISA試劑盒(?？焖倏梢曉袡z試劑盒)，在2016年3月～2017年2月期間，對(duì)北京市房山區(qū)某規(guī)?；?chǎng)的荷斯坦奶牛的168頭份血樣進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果與55～60d的直腸檢查結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，不同胎次奶牛的空懷檢測(cè)準(zhǔn)確率為97.68%～98.52%，懷孕檢測(cè)準(zhǔn)確率為98.51%～98.83%。ELISA檢測(cè)作為奶牛早期妊娠診斷的措施，對(duì)規(guī)模化牛場(chǎng)具有重大的意義。

奶牛 早期妊娠 ELISA ?？焖倏梢曉袡z試劑盒

對(duì)奶牛在人工受精一定時(shí)間后進(jìn)行精準(zhǔn)及時(shí)的早期妊娠檢測(cè)，在規(guī)?；?chǎng)繁殖管理程序中是一項(xiàng)十分重要而關(guān)鍵的任務(wù)。采用酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)對(duì)奶牛的早期妊娠狀況進(jìn)行診斷，即就是通過(guò)檢測(cè)從孕體、子宮、卵巢進(jìn)入母體血液、尿液或乳汁的妊娠相關(guān)物質(zhì)含量進(jìn)行妊娠診斷。奶牛的早期妊娠診斷在奶牛生產(chǎn)中具有重要意義，可以盡快重配空懷奶牛并縮短產(chǎn)犢間隔時(shí)間，從而為奶牛場(chǎng)帶來(lái)最高的牛奶產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。采用酶聯(lián)免疫測(cè)定法對(duì)待檢牛血清的檢測(cè)，操作快捷，結(jié)果準(zhǔn)確率高，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外針對(duì)人工授精的規(guī)?；?chǎng)已經(jīng)有廣泛應(yīng)用[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)人工受精后的奶牛進(jìn)行血清中妊娠相關(guān)糖蛋白(PAGs)的檢測(cè)，結(jié)合后期對(duì)人工授精后奶牛的跟蹤調(diào)查(結(jié)合55～60d的直腸檢查)，通過(guò)比較得出ELISA方法的空懷檢測(cè)準(zhǔn)確率和懷孕檢測(cè)準(zhǔn)確率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇2016年3月～2017年2月北京市房山區(qū)某規(guī)?；?chǎng)的荷斯坦奶牛，胎次在1.76～2.92之間，平均胎次為2.53。對(duì)人工授精后25～32d的成年母牛采集尾根血液5ml，以備分離血清，共采集了待檢奶牛血樣168頭份。

1.2 試驗(yàn)材料

37℃恒溫箱，Eppendorf 100～1000μl、20～200μl、2～20μl微量移液器各1把，各種規(guī)格移液器配套吸頭各一盒，吸水紙，?？焖倏梢曉袡z試劑盒(購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司)，去離子水。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 試劑盒及樣品的保存與使用 試劑盒一般應(yīng)保存于4℃冷藏保存，待檢血清一般應(yīng)于-20℃冷凍保存。在試驗(yàn)開始前至少30min開始做準(zhǔn)備，即將試劑盒中所有試劑及包被反應(yīng)板取出，恢復(fù)到室溫(18～26℃)，不同生產(chǎn)批次的試劑盒中所含檢測(cè)試劑不可混用。所有試劑使用前，應(yīng)輕輕渦旋、旋轉(zhuǎn)使其充分混勻。待檢血清可流水沖指型管或用手搓至融化，搖勻備用。

1.3.2 樣品的制備 將采集的血樣注入潔凈試管中，靜置至凝集后，待血凝塊周圍析出淡黃色液體時(shí)，可將試管移入冰箱4℃保存，待血清析出較多量時(shí)，吸取淡黃色液體至指型管中，即為待檢血清。

1.3.3 加樣 加樣前先于反應(yīng)板上標(biāo)記好因陽(yáng)性對(duì)照和所有樣品的位置，根據(jù)檢測(cè)需要取出所需數(shù)量的反應(yīng)板條，將未使用的反應(yīng)板條放入含有干燥劑的密封袋于2～8℃保存。每次加樣最好按設(shè)計(jì)好的反應(yīng)板布局、按統(tǒng)一順序加，避免樣本濺出或串孔，加樣時(shí)速度要保持一致，加樣后要輕彈反應(yīng)板，確保每個(gè)反應(yīng)孔中的液體充分混勻，同時(shí)盡量減少各樣品反應(yīng)時(shí)間的差異，計(jì)時(shí)要準(zhǔn)確。

1.3.4 孵育 加樣后微孔板必須用蓋板將反應(yīng)板蓋嚴(yán)，進(jìn)行室溫孵育時(shí)，控制室溫在18～26℃，避免在強(qiáng)光、熱源附近或通風(fēng)口等溫度不均勻的位置進(jìn)行孵育。

1.3.5 洗板 洗板時(shí)，將每個(gè)反應(yīng)孔加滿雙蒸水或去離子水(用移液槍加液時(shí)，每孔按300μl清洗)，共洗滌3次，每次浸泡時(shí)間一般為30s。每次洗板后快速翻轉(zhuǎn)反應(yīng)板，棄去洗液。將反應(yīng)板用力在吸水紙上拍干，確保每一個(gè)反應(yīng)孔中沒(méi)有殘留的洗液，同時(shí)避免手指接觸到孔內(nèi)。

1.3.6 反應(yīng)結(jié)果判讀 通過(guò)對(duì)比樣品和陰陽(yáng)性對(duì)照呈現(xiàn)的顏色來(lái)判斷每頭動(dòng)物的妊娠狀況。如果樣品反應(yīng)空中呈現(xiàn)的顏色比陰性對(duì)照孔淺或相同，則判定該動(dòng)物為空懷；如果樣品反應(yīng)孔中呈現(xiàn)藍(lán)色且比陰性對(duì)照孔深，則判為PAGs存在，該動(dòng)物處于妊娠期；如果樣品孔顏色很難用肉眼分辨，則被認(rèn)為可疑，建議重新采樣復(fù)檢。

2 結(jié)果

從2016年3月～2017年2月底，共計(jì)檢測(cè)了168頭份。以牧場(chǎng)55～60d的直腸檢查結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。人工授精后25～32d的血液檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率如附表：

附表 血液檢測(cè)結(jié)果與牧場(chǎng)妊娠檢測(cè)結(jié)果 (%)

空懷檢測(cè)準(zhǔn)確率為97.68%～98.52%，懷孕檢測(cè)準(zhǔn)確率為98.51%～98.83%。在產(chǎn)犢平均胎次為1.65的35份樣品中，空懷檢測(cè)準(zhǔn)確率為97.68%，懷孕檢測(cè)準(zhǔn)確率為98.51%；在產(chǎn)犢平均胎次為2.23的65份樣品中，空懷檢測(cè)準(zhǔn)確率為98.14%，懷孕檢測(cè)準(zhǔn)確率為98.72%；在產(chǎn)犢平均胎次為3.26的35份樣品中，空懷檢測(cè)準(zhǔn)確率為98.52%，懷孕檢測(cè)準(zhǔn)確率為98.83%。

3 討論

3.1 空懷檢測(cè)準(zhǔn)確率分析

空懷檢測(cè)準(zhǔn)確率是指人工授精后25～32d血液檢測(cè)空懷和55～60d直腸檢查結(jié)果空懷的比值。從附表結(jié)果看，這168份樣品的空懷檢測(cè)準(zhǔn)確率最理想可達(dá)到98.52%。懷孕檢測(cè)準(zhǔn)確率是指人工授精后25～32d血液檢測(cè)懷孕和55～60d直腸檢查結(jié)果懷孕的比值。從表1結(jié)果可以看出，懷孕檢測(cè)準(zhǔn)確率最理想可達(dá)到99.83%。檢測(cè)結(jié)果這說(shuō)明總有一定比例奶牛在55～60d直腸檢查為空懷，主要原因可能是胚胎30～56d容易發(fā)生早期死亡，有的能被發(fā)現(xiàn)，也有的不易觀察到[2]。這與Piechotta M等在2010年應(yīng)用IDEXX公司的奶牛PAG-ELISA妊娠檢測(cè)試劑盒對(duì)人工授精后28～58d的奶牛進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果(妊娠診斷準(zhǔn)確率能達(dá)到97.8%)基本一致[3]。

3.2 關(guān)于ELISA試劑盒

多種哺乳動(dòng)物在妊娠時(shí)，胎盤的滋養(yǎng)層雙核細(xì)胞會(huì)表達(dá)出一類蛋白物質(zhì)，叫做妊娠相關(guān)糖蛋白(PAG)，從外周血液中測(cè)定這種蛋白可疑作為是否有胎兒存在的指標(biāo)[4]。奶牛在妊娠后PAG濃度即開始緩慢上升，一直持續(xù)到妊娠的第22天，達(dá)到2ng/ml以上，此時(shí)，妊娠奶牛和非妊娠奶牛體內(nèi)PAG濃度有了明顯差別[5]。在本研究中，采用美國(guó)IDEXX公司的?？焖倏梢曉袡z試劑盒對(duì)奶牛血清樣品中的PAGs進(jìn)行檢測(cè)就可以較精準(zhǔn)的來(lái)判定奶牛是否懷孕。在使用試劑盒前，必須將試劑盒中所有的組分恢復(fù)到18～26℃，試劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)完全混合均勻，這樣才能保證所有檢測(cè)試劑的有效性與準(zhǔn)確性。

3.3 ELISA法進(jìn)行早期妊娠診斷的優(yōu)勢(shì)

本試驗(yàn)中采用的?？焖倏梢曉袡z試劑盒提供了一種可以精準(zhǔn)檢測(cè)懷孕的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，可以早在配種后28d就可以檢測(cè)到牛是否懷孕，在奶牛生產(chǎn)上對(duì)提高繁殖效率具有十分重要的意義。樣品可以實(shí)行批量檢測(cè)，特別適合規(guī)?；?chǎng)的獸醫(yī)進(jìn)行早期妊娠診斷，且空懷檢測(cè)準(zhǔn)確率為97.68%～100%，懷孕檢測(cè)準(zhǔn)確率為98.51%～98.83%，便于牛場(chǎng)管理者及時(shí)做出繁殖管理決策，對(duì)妊娠期的奶牛加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)，保證分娩的順利進(jìn)行；對(duì)未妊娠的奶牛及時(shí)處理，再次誘導(dǎo)排卵，進(jìn)行人工授精，縮短產(chǎn)犢間隔。

[1] Balhara K, GUPTA M, SINGH S, et al． Early pregnancy diagnosis in bovines: Current status and future directions[J]. The scientific world Journal, 2013: 1-10.

[2] 王傳蓉, 劉光磊, 張春剛等. “優(yōu)孕凱斯”檢測(cè)技術(shù)在奶牛早期妊娠診斷中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)奶牛. 2016(03): 25-28.

[3] Piechotta M,Bollwein J,Friedrich M, et al.Comparison of commercial ELISA blood tests for early pregnancy detection in dairy cows[J]. Report Dev, 2010, 45(1): 142-146

[4] 鐘旭, 薛立群, 田見(jiàn)暉. 妊娠相關(guān)糖蛋白(PAG)在奶牛早期妊娠診斷上的應(yīng)用現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2011, 38(11): 140-143.

[5] Friedrich M, Holtz W.Establishment of an ELISA for measuring bovin pregnancy-associated glycoprotein in serum or milk and its application for early pregnancy detection[J]. Repod Domest Anim, 2010,45(1): 142-146.

S818.9

A

1007-1733(2017)10-0012-02

北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院技術(shù)研發(fā)與示范推廣基金項(xiàng)目(XY-YF-16-09）

2017–05–25）