基于食品物理加工技術(shù)對(duì)大豆過(guò)敏原的影響

祖琴琴，華萍，龔育清，楊安樹 *，陳紅兵

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.江西省食品工業(yè)研究所，江西 南昌 330029）

大豆含有蛋白質(zhì)、異黃酮、低聚糖、皂苷及磷脂等營(yíng)養(yǎng)因子，因此其具有增強(qiáng)體質(zhì)和改善機(jī)體的抗病能力，還有降血壓，降低癌癥（包括腸和腎臟）、糖尿病和肥胖的發(fā)生率等許多重要的生理功能[1]。正因?yàn)槿绱?，大豆及其制品深受廣大消費(fèi)者青睞，其需求量也逐年上升。然而，大豆又是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）認(rèn)定的八大類過(guò)敏食品之一[2]，其過(guò)敏反應(yīng)90%都是由IgE介導(dǎo)而引發(fā)的[3]。據(jù)報(bào)道[4]大豆過(guò)敏患者約占食品過(guò)敏總?cè)藬?shù)的25%，而且多數(shù)為兒童，其中，大豆過(guò)敏兒童約占兒童過(guò)敏總?cè)藬?shù)的6%。迄今為止，大豆過(guò)敏尚無(wú)特效療法，應(yīng)嚴(yán)格避免食用含大豆的食品是大豆過(guò)敏患者的最佳選擇，但不是最佳的方法。因此，為了減少大豆過(guò)敏的危害，利用食品加工方法開發(fā)低致敏或脫敏的大豆制品刻不容緩。

目前脫敏食物加工方法主要包括物理加工和生物加工，本文則重點(diǎn)介紹物理加工對(duì)大豆過(guò)敏原的影響。

1 大豆主要過(guò)敏原

目前已發(fā)現(xiàn)38種大豆過(guò)敏原，其中認(rèn)為Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K和β-伴豆球蛋白中的Gly m Bd 60K是大豆3種主要過(guò)敏原[5]。

Gly m Bd 30K，又稱P34，是一種由379個(gè)氨基酸殘基組成、分子質(zhì)量為34u的單體，主要存在于7S蛋白中，約占大豆蛋白總含量的1%。目前發(fā)現(xiàn)，P34最少有5個(gè)表位能被過(guò)敏患者IgE所識(shí)別，分別位于氨基酸鏈中3～12、110～119、229～238、299～308和311～340處[6]，這些表位能被65%大豆過(guò)敏患者的血清所識(shí)別。因此，P34是大豆中致敏性最強(qiáng)的儲(chǔ)藏蛋白。

Gly m Bd 28 K，是一種由476個(gè)氨基酸殘基組成、分子質(zhì)量為26u、等電點(diǎn)為6.1的糖蛋白，主要存在于7S蛋白中。其致敏性表位最主要體現(xiàn)在N-末端氨基酸序列：FHDDEGGDKKSPKSLFLMSSTR[7]，可被25%大豆過(guò)敏患者血清所識(shí)別，它與多糖的結(jié)合位點(diǎn)位于多肽鏈170位天冬酰胺處，該多糖由甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、木糖及海藻糖以3:2:1:1的比例組成，去糖基化作用后可使其致敏性完全消失。

Gly m Bd 60K被定義為β-伴豆球蛋白的α亞基，是一種由543個(gè)氨基酸殘基組成、分子質(zhì)量為67u、等電點(diǎn)為4.9的糖蛋白，主要存在于7S蛋白中，含量約占β-伴豆球蛋白總量的45%。Gly m Bd 60K擁有15個(gè)線性表位，能與過(guò)敏患者血清結(jié)合的線性表位主要有 5個(gè)，分別位于氨基酸序列中 5～33、55～80、130～158、200～229和338～368處[4]，可被25%大豆過(guò)敏患者血清所識(shí)別。Gly m Bd 60K中的β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲易暴露在蛋白表面而與抗體結(jié)合，所以，其致敏性主要由β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的含量所決定。

2 物理加工對(duì)過(guò)敏原的影響

迄今為止，物理加工廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中，主要利用加熱、高壓、剪切力、輻照能等作用提高食品加工效率和降低食品中的有害因子。通過(guò)物理加工生產(chǎn)低致敏食品已受到國(guó)內(nèi)外食品企業(yè)的高度關(guān)注，其優(yōu)勢(shì)在于可以避免或者減少化學(xué)或生物學(xué)方法對(duì)食品造成的污染，防止?fàn)I養(yǎng)成分嚴(yán)重破壞和克服傳統(tǒng)加工耗時(shí)、投資成本高等缺陷。常見的物理加工過(guò)敏原的方法主要包括熱加工、輻照、高壓、高壓脈沖電場(chǎng)和超聲波等。

2.1 熱加工

熱加工是最常見的食品加工方法之一，其對(duì)食品致敏性會(huì)產(chǎn)生影響，研究表明[8]：加熱能使蛋白質(zhì)在一些共價(jià)或非共價(jià)作用下形成分子內(nèi)或分子間聚合物，這些聚合物在一定程度上掩蓋了過(guò)敏原的表位，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的致敏性。

抗原表位包括線性表位和構(gòu)象表位，線性表位比構(gòu)象表位穩(wěn)定，加熱主要通過(guò)改變蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，使其構(gòu)象表位發(fā)生改變，從而影響其致敏性[9]。Wilson[10]等研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白煮沸5min后P34的致敏性增強(qiáng)，而持續(xù)煮沸60min后致敏性則會(huì)減弱，這是因?yàn)镻34在煮沸過(guò)程中抗原表位先暴露后又被掩蓋，光譜學(xué)表征是二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量發(fā)生變化。另有報(bào)道[11]，P34在加熱溫度為121.1℃時(shí)，蛋白結(jié)構(gòu)會(huì)重新折疊，暴露出更多的過(guò)敏原表位，并與抗體結(jié)合，導(dǎo)致其致敏性增強(qiáng)。Bueks[12]等發(fā)現(xiàn)在80℃時(shí)7S和11S蛋白組分的致敏性會(huì)降低，而在100℃時(shí)又恢復(fù)到正常水平。另外，通過(guò)不同加熱方式處理豆類時(shí)，發(fā)現(xiàn)降低致敏性的效果與豆類的品種及含水量有關(guān)，如擠壓、烘烤、高壓蒸汽和微波處理扇羽豆后，結(jié)果表明僅有高壓蒸汽可以顯著地降低扇羽豆的致敏性[13]。

另有一些報(bào)道[14]發(fā)現(xiàn)熱加工在降低大豆致敏性效果方面并不理想，這是因?yàn)榧訜醿H會(huì)使大豆蛋白中的巰基和二硫鍵發(fā)生相互轉(zhuǎn)變，該轉(zhuǎn)變作用只對(duì)Kunitz胰蛋白酶抑制劑等產(chǎn)生作用，而大豆中多數(shù)過(guò)敏原如P34等表位結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，受熱加工的影響較小，所以單一的熱加工難以達(dá)到降低致敏性的效果。另外，熱加工還可能帶來(lái)食品安全隱患，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)a(chǎn)生致癌物質(zhì)[15]。

2.2 輻照

輻照的作用機(jī)理是當(dāng)射線與食品接觸后，將其部分能量傳遞給食品中的分子和原子，使原子變成離子，離子再通過(guò)電離輻射在食品中產(chǎn)生物理、化學(xué)和生物學(xué)效應(yīng)，以達(dá)到食品加工預(yù)期的要求和目的[16]。人們對(duì)輻照食品有所顧慮，通常認(rèn)為人體攝入輻照劑量不超過(guò)10kGy的食品是安全的[17]。

輻照能顯著的降低食品的致敏性，這是因?yàn)檩椪漳苁股锎蠓肿咏到?、交?lián)和分子構(gòu)象發(fā)生變化。輻照產(chǎn)生的能量促使蛋白質(zhì)從原來(lái)有序的緊密卷曲結(jié)構(gòu)向無(wú)序的松散結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，使分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露在分子表面，掩蓋過(guò)敏原表位，降低了食品的致敏性[18]。另外，顧可飛[19]認(rèn)為輻照降低食品致敏性主要通過(guò)兩種途徑，包括:（1）破壞B細(xì)胞或T細(xì)胞抗原表位的結(jié)構(gòu)；（2）輻照導(dǎo)致生物大分子交聯(lián)作用，使抗原表位被屏蔽。

Shawrang[20]等研究表明：經(jīng)γ輻照處理后的β-伴豆球蛋白α，和α亞基在瘤胃中消化降解的時(shí)間延長(zhǎng)，而β亞基沒有變化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，大豆球蛋白的酸性亞基發(fā)生降解，而堿性亞基沒有明顯變化，這是因?yàn)檩椪仗幚硎箟A性亞基表面更加緊密且含有更多的疏水區(qū)域，難以與消化酶接觸而發(fā)生降解[21]。利用輻照降低食品致敏性時(shí)，水分含量起著重要作用，如γ輻射對(duì)干大豆中Kunitz胰蛋白酶抑制劑活性影響不大，當(dāng)大豆中含有一定量水分時(shí)，即使輻射劑量很低也可使Kunitz胰蛋白酶抑制劑活性喪失，從而降低甚至完全消除Kunitz胰蛋白酶抑制劑的致敏性[22]。Kasera[23]等將加熱結(jié)合γ輻射來(lái)處理四季豆、黑綠豆和花生，這三種豆類在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgE的量分別減少了89%、87%和73%，而單獨(dú)使用γ輻射處理的豆類，致敏性并沒有明顯變化。另外，降低大豆蛋白的致敏性還可通過(guò)輻射處理獲得缺失過(guò)敏原的突變體來(lái)實(shí)現(xiàn)，如，日本科學(xué)家[24]通過(guò)γ輻射處理獲得了大豆的突變體即Tohoku124，該突變體缺失Gly m Bd 28K以及β-伴豆球蛋白的α，和α亞基。印度科學(xué)家[25]通過(guò)輻照處理獲得了缺乏大豆球蛋白A3亞基和β-伴豆球蛋白的α，和α亞基的大豆植株。

輻照改變蛋白的構(gòu)象主要取決于輻照劑量、樣品水分含量及蛋白濃度。輻照可促使過(guò)敏蛋白的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使抗原表位被掩蓋或丟失，且該種變化是不可逆的，因此，在輻照加工過(guò)程中，通過(guò)工藝控制可有效的降低過(guò)敏食品的致敏性。

2.3 高壓

高壓處理是指在室溫或加熱條件下將食品放入液體介質(zhì)中，利用100～1,000MPa的壓力作用一段時(shí)間使食品中相關(guān)成分的理化性質(zhì)發(fā)生變化。高壓主要通過(guò)改變過(guò)敏原蛋白的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)影響其致敏性[26]。壓力強(qiáng)度的改變對(duì)過(guò)敏蛋白致敏性的影響不同。研究顯示[27]，在200～300MPa高壓時(shí)，蛋白分子內(nèi)部的二硫鍵遭到破壞，導(dǎo)致天然蛋白結(jié)構(gòu)展開，同時(shí)游離的巰基含量增加，疏水基團(tuán)暴露在分子表面從而掩蓋過(guò)敏原表位，使大豆蛋白的致敏性降低；當(dāng)壓力達(dá)到300MPa時(shí)，大豆的致敏性降低了48.6%；但壓力超過(guò)300MPa時(shí)，蛋白分子中二硫鍵又會(huì)重新締合，游離的巰基含量和疏水性會(huì)逐漸減少，致敏性則會(huì)有所增強(qiáng)。有文獻(xiàn)報(bào)道[28]：將高壓和酶解相繼作用于大豆乳清時(shí)，可以顯著地降低過(guò)敏原Gly m 1的致敏性，且比單一處理效果更好。Pe? as[29]等在300Mpa高壓下處理大豆15min后再進(jìn)行發(fā)芽，發(fā)現(xiàn)經(jīng)高壓處理比未高壓處理的大豆芽的致敏性明顯降低，這可能是由于高壓處理促進(jìn)大豆在發(fā)芽的過(guò)程中，釋放出更多的內(nèi)源蛋白酶，使得過(guò)敏蛋白的水解更徹底。

眾多研究結(jié)果表明，高壓被認(rèn)為是降低大豆致敏性最有效的方法之一。高壓加工改變大豆蛋白致敏性受壓力強(qiáng)度、時(shí)間、大豆前處理等條件的影響。在一定的低壓范圍內(nèi)，過(guò)敏原表位被掩蓋，導(dǎo)致其抗原的致敏性降低；超過(guò)這一低壓范圍，過(guò)敏原表位會(huì)再次暴露，致敏性則會(huì)輕微的增強(qiáng)；但是壓力超過(guò)某一極限值以后，過(guò)敏蛋白的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且是不可逆的。

2.4 高壓脈沖電場(chǎng)

高壓脈沖電場(chǎng)（PEF）是以高電壓、短脈沖及溫和的溫度條件處理液態(tài)或半固態(tài)食品，由于脈沖處理時(shí)間短，熱能消耗少且?guī)缀醪划a(chǎn)生熱量，是一種新型的綠色加工技術(shù)[30]。利用PEF可改變大豆蛋白的分子結(jié)構(gòu)。已有文獻(xiàn)報(bào)道：在PEF處理大豆分離蛋白過(guò)程中，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表面的游離巰基、疏水性及溶解度都會(huì)發(fā)生改變，說(shuō)明PEF對(duì)大豆分離蛋白的二硫鍵和疏水作用有一定的影響；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)PEF對(duì)大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響并不顯著[31]。但也有報(bào)道稱[32]PEF會(huì)使大豆分離蛋白中β-折疊和不規(guī)則卷曲的含量增加。而中國(guó)科學(xué)家[4]就曾發(fā)現(xiàn)Gly m Bd 60K的致敏性主要是由β-折疊和不規(guī)則卷曲的含量決定的。PEF可以作用于7S和11S蛋白的表面極性氨基酸，使7S的α和α，亞基的末端氨基酸斷裂，同時(shí)極化了表面非極性氨基酸，從而破壞了空間結(jié)構(gòu)連接鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)中亞基組成發(fā)生變化[33]。上述研究表明：PEF顯示出調(diào)控過(guò)敏原致敏性表位的潛在價(jià)值。Robert[34]認(rèn)為高壓脈沖電場(chǎng)作用于蛋白溶液時(shí)會(huì)瞬間釋放一定的能量來(lái)改變蛋白分子間的自由焓，使氫鍵和范德華力發(fā)生變化，進(jìn)而改變分子間的靜電作用和疏水作用，從而可能對(duì)過(guò)敏原的致敏性產(chǎn)生影響。另有研究顯示[35]，PEF可以顯著地增強(qiáng)乳清蛋白與葡聚糖的糖基化交聯(lián)反應(yīng)，形成的聚合物可能會(huì)在一定程度上掩蓋過(guò)敏蛋白的表位。

目前關(guān)于高壓脈沖電場(chǎng)對(duì)食品致敏性的影響鮮有研究，國(guó)外關(guān)于高壓脈沖電場(chǎng)的研究才剛剛起步。相信，未來(lái)一段時(shí)期，高壓脈沖電場(chǎng)將在大豆及其制品的脫敏應(yīng)用中具有廣闊的前景。

2.5 超聲波

超聲波瞬間產(chǎn)生的空化作用使能量高度聚集，能量在崩潰瞬間會(huì)產(chǎn)生高溫、高壓等一系列極端的物理效應(yīng)，從而改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)[36]。

超聲波處理促使Kunitz胰蛋白酶抑制劑分子中二硫鍵斷裂，巰基和 β-折疊含量明顯增加，而β-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲含量則會(huì)降低，從而引起二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[37]。而Arzeni[38]研究顯示：當(dāng)大豆蛋白經(jīng)超聲波處理后，巰基含量并沒有發(fā)生變化，但表面疏水性卻顯著提高。超聲處理常作輔助手段結(jié)合其他方法加工處理大豆蛋白。如 Lin[39]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波可以顯著改善大豆分離蛋白中一些亞基(α-7S和 A-11S)與水解酶接觸的難易程度；高強(qiáng)度的超聲波可以通過(guò)影響氫鍵、相互疏水作用來(lái)改變蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，使更多的水解位點(diǎn)暴露于分子表面，促進(jìn)亞基與水解酶充分接觸。Mónica[40]在高強(qiáng)度超聲條件下使用胰蛋白酶消化魚中的主要過(guò)敏原β-小清蛋白，結(jié)果顯示超聲處理使該過(guò)敏原酶解更徹底。另有研究顯示[41]，低頻超聲可使7S蛋白發(fā)生聚合，使其一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，聚合物的形成可能使抗原表位被掩蓋。

超聲波能改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，而大豆的致敏性與過(guò)敏原的空間結(jié)構(gòu)緊密關(guān)聯(lián)，因此，超聲處理大豆過(guò)敏原勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致其致敏性發(fā)生變化。雖然，目前國(guó)內(nèi)外借助超聲波降低致敏性的研究很少，但其在降低大豆及其制品致敏性的應(yīng)用方面很令人期待。

3 展望

加工能夠影響過(guò)敏原表位的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變其致敏性，這是加工調(diào)控食物過(guò)敏原致敏性的重要支撐。如何采取有效的加工手段來(lái)降低或去除大豆及其制品的致敏性是解決大豆過(guò)敏的一項(xiàng)重要舉措。但某些單一的物理加工在降低大豆致敏性效果方面并不十分的理想，如輻照處理水分含量較低的過(guò)敏食品時(shí)很難降低其致敏性，而將各種物理加工以及物理-化學(xué)相結(jié)合的方法可顯著降低食品致敏性。另外，在食品過(guò)敏原蛋白的脫敏過(guò)程中，若從理論分析出發(fā)，將表位監(jiān)測(cè)和致敏性評(píng)估相結(jié)合，可以建立更加科學(xué)和精準(zhǔn)的脫敏新技術(shù)?？傊诮档痛蠖怪旅粜苑矫?，物理加工的工藝優(yōu)化和影響大豆致敏性機(jī)制等方面還有待進(jìn)一步研究。

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