牛脂聯(lián)素與肌內脂肪沉積的關系初探

■叢立新 張國良 李 鵬 張連江 張 輝

(1.吉林農業(yè)科技學院動物科技學院，吉林省吉林市 132101；2.吉林省農業(yè)科學院畜牧科學分院，吉林省吉林市 132101)

肌內脂肪含量與肉質密切相關，優(yōu)質牛肉肌內脂肪含量高，具有明顯的大理石紋。肌內脂肪影響肉的嫩度、風味、肉色、系水力[1]。脂聯(lián)素（adiponectin，ADPN）是脂肪細胞表達最豐富的細胞因子，大量存在于血液循環(huán)中。相關文獻表明，ADPN是脂肪代謝的重要調控因子[2]。本課題組成員研究結果，ADPN水平和奶牛圍產期的脂質代謝密切相關，脂聯(lián)素有望成為調節(jié)肉牛肌內脂肪最有前途的候選基因。

通過觀測延邊黃年、草原紅牛育肥的不同階段主要肌肉塊中肌內脂肪的含量、ADPN mRNA水平及其與肉牛肌肉大理石紋等級的關系，為探尋肉牛與肌內脂肪沉積相關的基因提供試驗基礎。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗設計與處理

各選擇30頭健康、體況相同、體重接近、18月齡左右的延邊黃牛和草原紅牛，分別隨機分成3個重復組，每個小組均10頭牛，供試肉牛單圈單槽飼喂。預試期10 d，精飼料日喂量逐漸增加到設定的營養(yǎng)水平后，進入正式肥育試驗期，肥育時間6個月（前期4個月，后期2個月）。試驗期間，分別于育肥的每月齡末采集脂肪樣品（尾部），熒光定量RT-PCR法檢測ADPN基因表達量（mRNA水平）。肥育期結束時從每個重復組中隨機抽測3頭肉牛屠宰。屠宰后采集眼肉等主要的肌肉樣品，檢測其脂肪的含量，評定大理石紋等級。

1.2 試驗試劑

1.2.1 主要試劑與工具酶

Trizol試劑購自Gibco公司；瓊脂糖（Promega）、酵母浸提物、Tris購自TaKaRa公司；焦磷酸二乙酯（DEPC）購自Sigm；乙醇、異丙醇、氯仿均為分析純國產試劑；乙二胺四乙酸鈉（EDTA）、十二基烷硫酸鈉（SDS）、飽和酚等為長春Biotech公司產品；標準分子量DL-2000 Marker購自TaKaRa公司。反轉錄酶AMV Reverse Transcriptase為NEB公司產品；T4 DNA連接酶、RNasin為Promage公司產品，Taq DNA聚合酶為TaKaRa公司生立，DH5α宿主菌為本實驗室自制。

1.2.2 主要儀器設備

恒溫空氣浴振蕩器（上海智城ZHWY-103D）；GeneQuant核酸濃度測定儀（英國pharmacia Biotech，Ltd公司）；不銹鋼數顯式鼓風干燥箱；紫外線透射反射儀WP型（永嘉上塘儀器廠）；脂肪測定儀（SZF-06A上海新嘉電子有限公司）；7930型高速冷凍立式離心機（日本KUBOTA公司）；PCR儀Tpersonal2000型(德國Biometra公司)、DY-Ⅲ型電泳儀（北京六一儀器廠）；恒溫水浴箱（丹東市醫(yī)療器械廠生產）；ABI PRISM 7000型熒光定量PCR擴增儀（美國ABI公司）。

1.3 日糧營養(yǎng)水平與飼養(yǎng)管理

試驗期間，同一肉牛品種同一育肥階段喂飼相同的日糧，不同育肥階段飼喂不同的日糧。粗飼料自由采食，以玉米秸桿為主。試驗期間肉牛日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.4 采集肉樣

分別于育肥的每月齡末，采集尾部脂肪樣品300 mg，存于液氮中備用。于育肥的22月齡末、24月齡末肉牛屠宰時，以眼肉評定大理石紋等級，并采集胴體中主要肌肉塊樣品：眼肉、胸肉、上腦、腱子肉、腰肉各100 mg于-20℃保存，待測肌內脂肪含量。

1.5 檢測指標

主要肌肉樣脂肪含量，為肌肉干物質中脂肪所占百分比IMF(mg/g)，（索氏浸提法）。

脂肪樣品中ADPN mRNA水平（熒光定量RTPCR法）。

肌肉大理石紋等級（中國優(yōu)質牛肉等級標準）。

1.6 肌肉大理石紋等級的評定

肉牛大理石紋等級參照“優(yōu)質牛肉系統(tǒng)評定方法和標準（96-003-04-12）”。對照大理石紋等級圖片，確定眼肌橫切面處大理石紋等級。大理石紋等級共分7個等級：1級、1.5級、2級、2.5級，3級、3.5級和4級。大理石紋極豐富為1級，豐富為2級，少量為3級，幾乎沒有為4級，介于兩級之間為0.5級[3]。

1.7 脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA水平檢測

Trizol兩步法提取脂肪組織總RNA，操作步驟按說明書進行。瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA條帶的完整性，測定RNA純度和濃度（DNA/RNA測量儀），將各樣品RNA用DEPC水調至相同濃度，反轉錄，制備成cDNA。利用Primer Express 2.0設計軟件，根據Genbank中ADPN序列，設計引物(上?；瞪锕こ坦竞铣?如表2。常規(guī)PCR。電泳后用凝膠試劑盒回收，連接到PMD18-T載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，克隆后提取質粒，進行重組質粒的PCR和雙酶切鑒定。將鑒定正確的陽性克隆送上海生工進行序列測定。

表1 延邊黃牛、草原紅牛育肥階段日糧組成及營養(yǎng)水平

1.8 熒光定量RT-PCR方法

將測序正確的質粒經純度及濃度測定后，用滅菌四餾水分別做梯度稀釋，作為RT-PCR反應的陽性標準模板，每個水平設3個重復、3個陰性質控（NTC）。PCR體系（25 μl）：ddH2O 16.2 μl；dNTPs Mixture（2.5 mM）2.0 μl；10×Taq-buffer 2.5 μl；上、下游引物（12 pmol/μl）各 1.0 μl、探針（15 pmol/μl）1.0 μl；Ex Taq 酶（1 U/μl）0.3 μl；temperate DNA 1.0 μl。反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，ABI PRISM 7000型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）中擴增50個循環(huán)。

表2 ADPN引物與探針

1.9 數據處理

統(tǒng)計學分析熒光定量測定的ADPN mRNA拷貝量，以平均值±標準差表示，用SPSS10.0軟件進行分析，One-Way ANOVA（方差分析）組間差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 肥育階段肉牛肌內脂肪沉積量(見表3)。

表3 肥育末期不同品種肉牛優(yōu)質切塊肌內脂肪含量(%)

統(tǒng)計結果（見表3）顯示，延邊黃牛與草原紅牛22月齡與24月齡眼肉、胸肉、腱子肉、腰肉、上腦肉肌內脂肪含量差異均顯著(P＜0.05)，表明，隨著育肥期的延長，延邊黃牛與草原紅牛肌內脂肪含量呈顯著增加趨勢。

2.2 延邊黃牛和草原紅牛不同肥育時期ADPN mRNA水平(見表4)

表4 各試驗組ADPN mRNA水平

分析結果顯示（見表4）：從19月齡到22月齡，延邊黃牛脂肪組織中ADPN mRNA水平均隨著育肥月齡的延長（除第一個月齡外）有增加的趨勢(P＜0.05)，育肥期繼續(xù)延長至24月齡，ADPN mRNA水平又極顯著下降(P＜0.01)；草原紅牛從19月齡到22月齡，其脂肪組織中ADPN mRNA水平均隨著育肥期的延長而增加(P＜0.05)，育肥期繼續(xù)延長至24月齡，ADPN mRNA水平極顯著下降(P＜0.01)。

2.3 延邊黃牛和草原紅牛ADPN mRNA水平與肌肉大理石紋的關系

表5 肥育末期肉牛肌肉大理石紋等級

本試驗結果（見表3）：24月齡末的延邊黃牛和草原紅牛眼肉脂肪含量均顯著高于22月齡末(P＜0.05)；無論是延邊黃牛還是草原紅牛，24月齡時大理石紋均為3級，22月齡時肌肉大理石紋均為3.5級（見表5）。

3 討論

近年來，研究者運用分子生物學方法對脂聯(lián)素的生理功能的研究不斷深入。脂聯(lián)素mRNA在豬脂肪細胞中表達豐富[4]。Ding（2004）認為脂聯(lián)素可能通過受體在豬的不同組織發(fā)揮生理作用。Sreenivasa等研究結果提示ADPN在雞的體內可能發(fā)揮與哺乳動物不一樣的生物學功能[5]。Fu等（2005）研究表明，經基因轉染而表達的脂聯(lián)素通過自分泌可促進脂肪細胞脂質的聚積[4]。本課題組試驗結果：體外試驗提示，新生荷斯坦乳用犢牛脂肪前體細胞ADPN mRNA上調脂肪細胞內脂肪蓄積，但當脂質蓄積到一定程度時，會呈現類似于人體肥胖時的脂聯(lián)素低表達的現象[6]；奶牛的圍產期間，ADPN可通過激素和代謝中間產物參與脂肪代謝的調節(jié)，提示ADPN可能是奶牛脂代謝中重要的調節(jié)因子[7]；延邊黃牛與雜交肉牛脂聯(lián)素的基因表達與肌內脂肪含量密切相關，但與遺傳基礎不同的其他肉牛是否具有同樣的結果，尚需要進一步研究[8]。

本試驗結果：延邊黃牛、草原紅牛眼肉脂肪含量24月齡時顯著高于22月齡(P＜0.05)（見表3）。肌肉大理石紋主要決定于肌內脂肪的含量，從表5可見，延邊黃牛、草原紅牛22月齡時肌肉大理石紋均為3.5級，24月齡時大理石紋均為3級。提示，從22月齡到24月齡內，延邊黃牛與草原紅牛的ADPN mRNA水平與肌肉大理石紋有呈負相關的趨勢。延邊黃牛、草原紅牛肌內脂肪含量從18月齡到22月齡期間增加（P＜0.05），ADPN mRNA水平也呈增加趨勢（P＜0.05）。提示，在肉牛的育肥前期ADPN mRNA水平與肌肉大理石紋有正相關的趨勢。延邊黃牛、草原紅牛的育肥階段，從18月齡始前4個月，ADPN mRNA與肌內脂肪量均呈正相關（延邊黃牛r=0.62；P＜0.001，n=9）、（草原紅牛 r=0.78；P＜0.001），而肥育的后2個月，ADPN mRNA與肌內脂肪量均呈負相關（延邊黃牛 r=-0.67；P＜0.001，n=9）和（草原紅牛r=-0.81；P＜0.001，n=9）。是脂聯(lián)素基因的表達量降低上調了肌內脂肪的沉積，還是肌內脂肪的沉積上調了脂聯(lián)素基因表達的下降尚不明確。但是否提示可以將脂肪細胞因子脂聯(lián)素作為肉牛肌內脂肪調控的一個后選基因，目前尚無相關文獻報道。鑒于本試驗樣本數少，對脂聯(lián)素基因表達與肉牛肌肉大理石紋的關系還有待于進一步研究。

4 結論

延邊黃牛、草原紅牛的ADPN mRNA水平在育肥的18月齡始到24月齡末階段，前4個月與肌內脂肪含量均正相關，后2個月均呈負相關。提示，延邊黃牛與草原紅牛的ADPN mRNA水平與肌肉大理石紋均有相關性。