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    混菌固態(tài)發(fā)酵銀杏葉渣生產(chǎn)蛋白飼料的研究

    2014-12-04 03:56:10王成章葉建中陳虹霞
    飼料工業(yè) 2014年1期
    關(guān)鍵詞:假絲枯草銀杏葉

    周 昊 王成章 葉建中 陳虹霞 陶 冉

    (1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室;國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室,江蘇南京 210042;2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所,北京 100091)

    隨著畜牧業(yè)的發(fā)展,飼料的需求量越來越大。而飼料生產(chǎn)量,尤其是蛋白飼料的不足已經(jīng)成為全球性問題,因此積極利用各種廢棄物生產(chǎn)蛋白飼料已成為國內(nèi)外研究的熱點[1-2]。銀杏葉渣是生產(chǎn)銀杏提取物過程中產(chǎn)生的廢渣,我國每年大概產(chǎn)生3萬噸的銀杏葉渣,銀杏葉渣中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、VC、VE、胡蘿卜素、礦物質(zhì)和微量元素等營養(yǎng)成分,目前銀杏葉渣大多未加利用,被直接扔掉或焚燒,不僅造成資源的嚴重浪費,而且嚴重污染環(huán)境[3-4]。

    固態(tài)發(fā)酵技術(shù)相對于液態(tài)發(fā)酵技術(shù)具有高產(chǎn)、簡易、低投資、低能耗等優(yōu)點[5],特別是應(yīng)用于廢渣廢料的處理,易干燥、高回收,可把發(fā)酵物(包括發(fā)酵底物、菌體及其代謝產(chǎn)物)全部利用,既保留了活性成分又不會產(chǎn)生廢液污染[6]。因此利用微生物固態(tài)發(fā)酵技術(shù),用銀杏葉提取物加工過程中產(chǎn)生的大量銀杏葉渣生產(chǎn)出蛋白飼料,提高銀杏葉渣的蛋白質(zhì)含量及營養(yǎng)價值,可變廢為寶,開辟飼料新資源,避免廢渣對環(huán)境的污染,具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益。本研究以銀杏葉渣為原料,以米曲霉、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和熱帶假絲酵母混合菌種為發(fā)酵菌種,研究了銀杏葉渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料適宜的工藝條件,對提高銀杏葉渣的綜合利用價值,減少環(huán)境污染具有深遠的意義。

    1 試驗材料與儀器

    1.1 材料

    原輔料:銀杏葉渣:由邳州鑫源生物制品有限公司提供。本文中若無特別說明,藥渣質(zhì)量均以絕干物料計量。

    試劑:尿素、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀等,均為分析純。

    培養(yǎng)基:麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基:5°Bé~6°Bé,pH值約為6.5,加入2 g/100 ml瓊脂即可。不加瓊脂即為麥芽汁液體培基。

    Czapek’s瓊脂培養(yǎng)基:蔗糖3%,NaNO30.3%,MgSO4·7H2O 0.05%,KCl 0.05%,F(xiàn)eSO4·4H2O 0.001%,K2HPO40.1%,瓊脂1.5%,pH值6.0~6.5。

    PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯浸取液中加入2%葡萄糖和1.5%瓊脂。

    MRS培養(yǎng)基:酪蛋白胨1%,牛肉膏1%,酵母膏0.5%,葡萄糖0.5%,乙酸鈉0.5%,檸檬酸二胺0.2%,吐溫80 0.1%,K2HP040.2%,MgS04·7H2O 0.02%,MnSO4·H2O 0.005%,CaCO32%,瓊脂1.5%,pH 6.8。

    BPY瓊脂培養(yǎng)基:牛肉膏0.5%,蛋白胨1%,酵母膏0.5%,葡萄糖0.5%,NaCl 0.5%,瓊脂1.5%,pH7.0。

    1.2 試驗菌種

    熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)2.1776、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)2.1059、白地霉(Geotrichum candidum)2.1132、米曲霉(Aspergillus oryzae)3.5232、黑 曲 霉(Aspergillusniger)3.5439、綠 色 木 霉(Trichoderma viride)3.5455、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)1.1630、植 物 乳 桿 菌(Lactobacillus plantarum)1.0556(中國普通微生物菌種保藏管理中心)。

    1.3 試驗儀器

    生化培養(yǎng)箱(RXZ-280B):寧波江南儀器廠;往復(fù)式水浴恒溫搖床(ZWY-110X30):上海智城分析儀器制造有限公司;凱氏定氮儀(KDN-08D):上海昕瑞儀器儀表有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-30KBS):上海申安醫(yī)療器械廠;潔凈工作臺(SW-CJ-2D)∶蘇州凈化設(shè)備有限公司。

    2 試驗方法

    2.1 菌種的擴大培養(yǎng)[7]

    黑曲霉菌和米曲霉菌:分別將黑曲霉菌、米曲霉菌原種接到Czapek’s瓊脂斜面培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)72 h,再接到250 ml三角瓶Czapek’s液體培養(yǎng)基中,28℃恒溫搖床(120 r/min)培養(yǎng)72 h。

    熱帶假絲酵母菌、產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉:分別將熱帶假絲酵母菌、產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉原種接到麥芽汁斜面培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)72 h,再接到250 ml三角瓶麥芽汁液體培養(yǎng)基中,28℃恒溫搖床(120 r/min)培養(yǎng)72 h。

    綠色木霉:將綠色木霉原種接到PDA斜面培養(yǎng)基上,在28℃培養(yǎng)72 h,再接到250 ml三角瓶PDA液體培養(yǎng)基中,28℃恒溫搖床(120 r/min)培養(yǎng)72 h。

    枯草芽孢桿菌:將枯草芽孢桿菌原種接到BPY瓊脂斜面培養(yǎng)基上,在28℃培養(yǎng)72 h,再接到250 ml三角瓶BPY液體培養(yǎng)基中,28℃恒溫搖床(120 r/min)培養(yǎng)72 h。

    植物乳桿菌:將植物乳桿菌原種接到MRS斜面培養(yǎng)基上,在28℃培養(yǎng)72 h,再接到250 ml三角瓶MRS液體培養(yǎng)基中,28℃恒溫搖床(120 r/min)培養(yǎng)72 h。

    2.2 銀杏葉渣發(fā)酵工藝流程

    斜面菌種→種子培養(yǎng)↓銀杏葉渣→干燥→粉碎過40目篩→配料→混合→固態(tài)恒濕發(fā)酵→烘干至恒重→分析測定。

    2.3 銀杏葉渣固態(tài)發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

    2.3.1 單一菌種發(fā)酵試驗

    在250 ml的錐形瓶中裝入混合均勻的銀杏葉渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基,料水比為1∶3,氮源添加量為5%,滅菌,冷卻后,分別接入10%的熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉、米曲霉、黑曲霉、綠色木霉、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌,在30℃,自然pH值下靜止發(fā)酵72 h后,將產(chǎn)物在50℃條件下烘干至恒重,分析測定其粗蛋白含量。

    2.3.2 復(fù)合菌種發(fā)酵試驗[8]

    將單菌發(fā)酵試驗中篩選出的粗蛋白含量較高的酵母菌、霉菌與植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌進行進行2菌(接種比例1∶1)、3菌(接種比例1∶1∶1)和4菌(接種比例1∶1∶1∶l)的復(fù)合發(fā)酵試驗。復(fù)合菌種的組合有7種,分別為①霉菌+酵母菌;②霉菌+枯草芽抱桿菌;③霉菌+植物乳桿菌;④霉菌+酵母菌+枯草芽抱桿菌;⑤霉菌+酵母菌+植物乳桿菌;⑥霉菌+枯草芽抱桿菌+植物乳桿菌;⑦霉菌+酵母菌+枯草芽抱桿菌+植物乳桿菌。

    2.3.3 最佳菌種比例試驗[9]

    為得到最佳菌種比例組合,向固體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別按10%的接種量接入不同比例的酵母菌、霉菌、枯草芽抱桿菌和植物乳桿菌的菌液,進行發(fā)酵試驗,接種比例分別為 1∶1∶2∶1、2∶2∶1∶1、1∶2∶2∶1、2∶1∶1:1、2∶1∶2∶1、1∶2∶1∶1,測定發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量。

    2.3.4 接種量的確定[10]

    將篩選出的復(fù)合菌種分別按6%、8%、10%、12%、15%的接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基,料水比為1:3,氮源添加量為8%,滅菌,冷卻后,在30℃,自然pH值下靜止發(fā)酵72 h后,將產(chǎn)物在50℃條件下烘干至恒重,分析測定其粗蛋白含量。

    2.3.5 發(fā)酵時間的確定

    將篩選出的復(fù)合菌種分別按10%的接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基,料水比為1:3,氮源添加量為8%,滅菌,冷卻后,在30℃,自然pH值下,分別靜止發(fā)酵A:24 h,B:48 h,C:72 h,D:96 h,E:120 h,將產(chǎn)物在50℃條件下烘干至恒重,分析測定其粗蛋白含量。

    2.3.6 料水比的確定[11]

    將篩選出的復(fù)合菌種分別按10%的接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基,料水比分別取1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5,氮源添加量為8%,滅菌,冷卻后,在30℃,自然pH值下,分別靜止發(fā)酵72 h,將產(chǎn)物在50℃條件下烘干至恒重,分析測定其粗蛋白含量。

    2.3.7 氮源(尿素)添加量的確定[12]

    將篩選出的復(fù)合菌種分別按10%的接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基,料水比為1:3,分別選取尿素和硫酸銨作為培養(yǎng)基氮源,氮源添加量分別為3%、5%、8%、10%、12%,滅菌,冷卻后,在30℃,自然pH值下,分別靜止發(fā)酵72 h,將產(chǎn)物在50℃條件下烘干至恒重,分析測定其粗蛋白含量。

    2.4 指標成分測定方法

    銀杏葉渣中粗蛋白測定采用凱氏定氮法(GB/T6432-94),粗纖維測定采用酸堿洗滌法(GB/T6434-94),粗灰分測定采用高溫灼燒法(GB/T6438-2007),粗脂肪測定采用索氏提取法(GB/T6433-94),多糖測定采用硫酸蒽酮法(GB/T15038-2006)。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 單一菌種發(fā)酵試驗(見圖1)

    從圖1可以看出,向固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入單一菌種均能提高發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量,而發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量最高的4種菌種為A熱帶假絲酵母(28.22%)、D米曲霉(32.55%)、G枯草芽抱桿菌(29.01%)和H植物乳桿菌(27.97%)。加入熱帶假絲酵母后的固體發(fā)酵產(chǎn)物中,有淡淡的醇香味,粗蛋白含量提高2.06倍,其原因在于熱帶假絲酵母自身中的菌體蛋白含量比較高;加入枯草芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量可以提高2.14倍,這是由于其菌體內(nèi)具有活性較高的蛋白酶,可用合成大量的蛋白質(zhì),來提高粗蛋白含量;加入米曲霉,發(fā)酵產(chǎn)物表面形成大片的白色菌絲體,之后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色,發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量提高了2.53倍,其原因是米曲霉可產(chǎn)生大量的淀粉酶、纖維素酶、果膠酶和蛋白酶,能使銀杏葉渣中的纖維素分解為可利用的碳源,促進發(fā)酵效果,同時產(chǎn)生蛋白質(zhì);加入植物乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量可以提高2.03倍,其原因在于其可產(chǎn)生大量的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等消化酶,從而可促進蛋白質(zhì)的合成。因此,在以后的混合菌種發(fā)酵試驗中所選用的菌株為:A熱帶假絲酵母、D米曲霉、G枯草芽抱桿菌和H植物乳桿菌。

    3.2 復(fù)合菌種發(fā)酵試驗

    根據(jù)單一菌種發(fā)酵實驗結(jié)果選出的發(fā)酵產(chǎn)品蛋白含量較高的熱帶假絲酵母、米曲霉、枯草芽抱桿菌和植物乳桿菌進行復(fù)合菌種的組合試驗,分別為D+A(米曲霉+熱帶假絲酵母)、D+G(米曲霉+枯草芽孢桿菌)、D+H(米曲霉+植物乳桿菌)、D+A+G(米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌)、D+A+H(米曲霉+熱帶假絲酵母+植物乳桿菌)、D+G+H(米曲霉+枯草芽孢桿菌+植物乳桿菌)、D+A+G+H(米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌+植物乳桿菌)。

    從圖2可以看出,3菌和4菌組合發(fā)酵的產(chǎn)物的粗蛋白含量明顯高于2菌組合,其中米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌的3菌組合和米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌+植物乳桿菌的4菌組合發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量最高,分別為40.57%和41.26%。通過觀察發(fā)酵產(chǎn)物,在產(chǎn)物表面及內(nèi)部有大量菌絲體,發(fā)酵產(chǎn)物成褐色,具有濃郁的酒香味。分析其中原因,是因為米曲霉能夠產(chǎn)生多種纖維素酶類和果膠酶類,這些酶類有助于銀杏葉渣中纖維素的降解,同時產(chǎn)生糖類物質(zhì),而枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母可以利用這些糖類物質(zhì)大量生產(chǎn)并產(chǎn)生菌體蛋白,通過復(fù)合菌劑中不同微生物的協(xié)同作用最終提高發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量。由于米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌的3菌組合和米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌+植物乳桿菌的4菌組合發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量相差不大,但是考慮到植物乳桿菌發(fā)酵可產(chǎn)生乳酸,可使物料處于低酸度的環(huán)境,從而有效防止有機物質(zhì)和原料的變質(zhì),使有益微生物急劇增加,抑制了有害細菌的生長,能增強動物的體液免疫和細胞免疫,另外加入植物乳桿菌還可以改善飼料的適口性。綜合考慮,選擇最佳菌種組合為米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌+植物乳桿菌。

    3.3 最佳菌種比例試驗(見圖3)

    由圖3可知,當(dāng)熱帶假絲酵母、米曲霉、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的接種比例為2∶2∶1∶1時,發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量最高,達到45.85%。接入米曲霉比例為1時的菌種組合的發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量都偏低,這是由于米曲霉產(chǎn)生的糖化酶及纖維素酶減少,不利于銀杏葉渣中的纖維素分解。同時發(fā)酵物料中可利用的糖減少,使得熱帶假絲酵母、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的生長繁殖受到限制。此外,熱帶假絲酵母對發(fā)酵產(chǎn)物的適口性有較大影響,不能含量過少。所以確定米曲霉、熱帶假絲酵母、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的最佳接種比例為2∶2∶1∶1。

    3.4 接種量的確定(見圖4)

    從圖4可以看出,接種量為10%時,發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量最高,為45.38%,當(dāng)接種量增加為12%時,發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量未見增長。而當(dāng)接種量為15%時,發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量反而降低,原因可能是接種量過大,使菌種生長過快,培養(yǎng)物黏度增加,導(dǎo)致溶氧不足,影響產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的合成。從生產(chǎn)考慮,接種量的減少意味著生產(chǎn)便利和成本的降低,因此應(yīng)該在允許的范圍內(nèi)盡可能降低接種量。本試驗10%和12%接種量對發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量影響差異不顯著。從節(jié)約生產(chǎn)成本角度,綜合考慮,選擇10%的接種量最為合適。

    3.5 發(fā)酵時間的確定(見圖5)

    從圖5可以看出,隨著發(fā)酵時間的增加,發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量呈現(xiàn)先升后將的趨勢,粗蛋白含量最高的發(fā)酵時間是72 h,可達到45.39%;繼續(xù)增加發(fā)酵時間,發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白含量反而降低,且霉味強烈。這是因為在發(fā)酵時間不夠的情況下,菌體生長不完全,發(fā)酵底物沒有被微生物完全分解利用,發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量比較低;發(fā)酵時間過長,菌體出現(xiàn)自然溶解現(xiàn)象,使得發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量不高,酸度過大,米曲霉生成大量的孢子使適口性降低,枯草芽孢桿菌生成芽孢,使得粗蛋白含量進一步降低。綜合分析我們選擇最合適的發(fā)酵時間為72 h。

    3.6 料水比的確定(見圖6)

    水分是微生物所必需的基本物質(zhì)之一,每種微生物都具有最適宜其生長的水分含量,這是因為水是微生物細胞的重要組成部分,是微生物進行代謝活動的介質(zhì),同時還參與一部分生化反應(yīng)。

    從圖6可以看出,隨著料水比的增加,粗蛋白含量先是增加然后逐漸降低,在料水比為1∶3時,發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量達到最高為45.13%,繼續(xù)增加料水比,發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白含量呈降低趨勢。這是因為當(dāng)培養(yǎng)基中含水量偏低時,造成基質(zhì)膨脹度過低,微生物的生長受到抑制,后期由于微生物生長及蒸發(fā)造成發(fā)酵底物較干,微生物難以生長,粗蛋白含量不會很高;當(dāng)培養(yǎng)基中含水量偏高時,會導(dǎo)致基質(zhì)多孔性降低,發(fā)酵物黏度過大,減少基質(zhì)內(nèi)氣體的體積和氣體交換,難以通風(fēng)、降溫,微生物生長受到抑制,發(fā)酵產(chǎn)品的粗蛋白含量降低。所以最終選擇料水比為1∶3。

    3.7 氮源(尿素)添加量的確定(見表1)

    本試驗中的銀杏葉渣其氮含量較低,并且組分多為不溶性的碳水化合物,由于發(fā)酵底物自身原因的限制,在試驗和實際生產(chǎn)中如果不添加一定的氮源,很難滿足微生物生長的需要,同時也無法達到生產(chǎn)蛋白飼料的要求。根據(jù)以往相關(guān)試驗的經(jīng)驗,我們選擇了尿素和硫酸銨分別作為氮源進行對比試驗,每種氮源的添加比例分別為3%、5%、8%、10%和12%。

    表1 不同氮源及添加量對發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白的影響(%)

    由表1我們可以看出,尿素和硫酸銨兩種氮源對發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量都能提高,在相同情況下尿素對發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量的增幅高于硫酸銨。在尿素添加量為8%時,發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量可達45.69%;在硫酸銨的添加量在12%時,發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量可達45.02%。

    同時我們還能看出,隨著尿素添入比例的增加,發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量,先升高,隨后又有降低的趨勢。歸其原因,在于尿素的添加在一定程度上彌補了發(fā)酵底物中氮含量的不足,促進微生物生產(chǎn),但是隨著尿素添加量的增加,尿素的利用率下降,未被利用的尿素游離出的銨離子改變了發(fā)酵環(huán)境中pH值,最終影響微生物的正常生長。同時尿素添加量超過8%,發(fā)酵產(chǎn)物含有一定的氨氣味道,隨著添加比例的增加,氣味逐漸變強,嚴重影響牲畜的適口性。在氮源的添加問題上,尿素的添加量要比硫酸銨較少,而且尿素的成本要小于硫酸銨,同時硫酸銨含氮量較低,過量的使用會使硫酸根離子過多,使得培養(yǎng)基偏酸性,這對于發(fā)酵是不利的。所以出于經(jīng)濟效益上、微生物有利生長及發(fā)酵產(chǎn)品適口性三方面的綜合考慮,我們選擇尿素為固體培養(yǎng)基發(fā)酵時添加的唯一氮源,并且添加量為8%。

    3.8 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物成分分析

    在確定的發(fā)酵工藝下,發(fā)酵產(chǎn)物呈現(xiàn)褐色,濃密狀,有濃郁的醇香味,無霉味,含水量約為10%。測定發(fā)酵產(chǎn)物各成分含量并與原料比較結(jié)果見表2。

    表2 發(fā)酵產(chǎn)物成分分析(%)

    4 結(jié)論

    通過對銀杏葉渣的發(fā)酵工藝條件的研究,最終確定的最佳工藝條件是:熱帶假絲酵母、米曲霉、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的接種比例為2∶2∶1∶1,接種量 10%,添加尿素8%,料水比1:3,發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵時間72 h。由發(fā)酵產(chǎn)物檢測結(jié)果可以看出,發(fā)酵產(chǎn)物的主要營養(yǎng)成分較原料有明顯提高,粗蛋白含量由8.41%提高至45.69%,提高了443.28%,粗脂肪含量由8.74%提高至10.25%,提高了17.28%,粗灰分含量由16.91%提高至23.91%,提高了41.40%,粗多糖含量由2.45%提高至3.67%,提高了49.80%,粗纖維由17.24%降低至8.13%,降低了52.84%。銀杏葉渣經(jīng)固態(tài)發(fā)酵,粗蛋白、粗脂肪、粗多糖等主要成分含量顯著提高,營養(yǎng)價值增加。

    該生產(chǎn)工藝解決了林業(yè)產(chǎn)品加工廢棄物銀杏葉渣浪費和對環(huán)境污染的問題,為畜牧業(yè)的發(fā)展提供了新型微生物發(fā)酵蛋白飼料,該工藝簡單易行、便于操作,降低了生產(chǎn)成本,提高了經(jīng)濟效益,有廣闊的應(yīng)用前景。

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