PVA加門腔分流術(shù)對肝硬化大鼠肝臟組織中iNOS水平的影響

蔡潮農(nóng)，方瑞君，李培平，張百萌，關(guān)曉東，李 堅

(1中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東珠海519000;2北京師范大學(xué)珠海校區(qū)門診部)

門靜脈動脈化(PVA)在肝硬化門靜脈高壓癥及肝臟外科方面有良好的應(yīng)用前景，但目前研究發(fā)現(xiàn)該技術(shù)尚存在一些問題，比如長期未加限流措施的動脈化或未行門靜脈分流的動脈化可能導(dǎo)致肝臟實質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，包括門脈內(nèi)膜纖維化、壞死性血管炎、肝實質(zhì)纖維化等［1，2］。正常情況下，肝組織中主要表達內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)無或僅有少量表達，后者在肝組織受到內(nèi)毒素(LPS)、腫瘤壞死因子(TNF)及干擾素lp(IFN-lp)等細胞因子刺激后表達增加，活性可持續(xù)較長時間，催化NO大量持續(xù)產(chǎn)生，介導(dǎo)廣泛的毒性作用［1，3］。在氧化應(yīng)激造成的肝損傷中，iNOS的表達與肝細胞壞死程度有關(guān)［4］。2012年11月～2013年12月，我們觀察了PVA加門靜脈分流術(shù)(PCS)對肝硬化大鼠肝組織中iNOS表達的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 模型建立與分組處理 健康雄性 Sprague-Dawley大鼠190只，體質(zhì)量(250±20)g，SPF級，由中山大學(xué)實驗動物中心提供。參照文獻［5］采用純四氯化碳(CCl4)制作肝硬化模型，造模期間飲含100 mL/L乙醇的水溶液，造模期間死亡35只。按Ishak肝纖維化分級評分標(biāo)準(zhǔn)［6］達到肝硬化標(biāo)準(zhǔn)有139只。制模成功后，術(shù)前隨機抽10只肝硬化大鼠為對照，再隨機抽取40、40、20只，分別納入 A、B、C組。A組參考文獻［7～10］行PVA加PCS:利用大鼠右腎動脈、靜脈實現(xiàn)入肝門脈動脈化及門腔分流;B組只行PCS，采用門脈遠端與右腎靜脈吻合，近端門脈縫閉;C組為空白對照，僅行門脈阻斷+右腎切除，阻斷門脈時間依據(jù)A、B組動物阻斷門脈的平均時間，阻斷持續(xù)30 min。

1.2 肝組織iNOS表達檢測 術(shù)前及A、B組術(shù)后1、2、4、8周分別處死10只大鼠、C組術(shù)后相同時間點各處死5只大鼠。取肝臟組織，采用免疫組化SP法檢測肝細胞中的iNOS。光鏡下觀察iNOS陽性細胞胞質(zhì)呈棕黃色，每張切片選取四周及中央5個區(qū)域，采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件分析圖片胞質(zhì)棕黃色顆粒面積、平均光密度(MOD)及累積光密度 (IOD，面積×平均光密度)，5張照片取均數(shù)，代表iNOS表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性符合條件后，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD檢驗;計量資料比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

三組術(shù)后各時點iNOS表達水平均低于術(shù)前(P均 ＜0.05)。A 組術(shù)后1、2、4 周 iONS表達高于 B、C組(P均＜0.01)，而術(shù)后8周，三組iNOS表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。三組術(shù)前及術(shù)后不同時點iNOS表達變化趨勢見圖1。

3 討論

研究表明，PVA+PCS可顯著改善肝硬化大鼠肝功能及儲備功能，促進肝硬化大鼠肝組織細胞再生、增殖［9～12］，穩(wěn)定入肝門靜脈的動脈血流［13，14］，在肝硬化門靜脈高壓癥的治療方面具有明顯優(yōu)勢，同時對于肝移植、急性肝功能衰竭、手術(shù)難以切除肝門部腫瘤的手術(shù)治療也有廣闊的應(yīng)用前景［15，16］。但目前也發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在的一些問題，如長期未加限流措施的動脈化可能導(dǎo)致肝臟實質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，包括門脈內(nèi)膜纖維化，肝實質(zhì)纖維化，原因可能與肝臟前膠原蛋白ⅠmRNA表達上調(diào)，翻譯合成膠原蛋白增加有關(guān)［1，2］。

表1 各組肝組織iNOS相對表達量比較(±s)

表1 各組肝組織iNOS相對表達量比較(±s)

注:與術(shù)前相比，*P ＜0.05;與 A組同期相比，#P ＜0.01

組別 n iNOS A 組術(shù)前 10 600 583±32 828術(shù)后1周 10 560 372±35 878*術(shù)后2周 10 247 237±31 738*術(shù)后4周 10 407 727±39 964*術(shù)后8周 10 413 169±37 522*B組術(shù)前 10 600 583±32 828術(shù)后1周 10 221 381±39 341*#術(shù)后2周 10 271 642±37 357*#術(shù)后4周 10 383 416±37 588*#術(shù)后8周 10 354 977±37 586*C組術(shù)前 10 600 583±32 828術(shù)后1周 5 258 247±40 565*#術(shù)后2周 5 209 783±36 796*術(shù)后4周 5 321 239±39 596*#術(shù)后8周 5 287 126±30 730*

圖1 各組手術(shù)前后肝組織中iNOS表達變化趨勢(400×)

NOS至少有三種亞型，分別為eNOS、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)和iNOS。肝臟內(nèi)主要存在eNOS和iNOS兩種類型，eNOS存在于肝內(nèi)血管和血竇內(nèi)皮細胞中;iNOS則表達于肝細胞、Kupffer細胞和肝星狀細胞。在正常情況下，肝組織中主要表達eNOS，在許多物質(zhì)如內(nèi)毒素(LPS)、腫瘤壞死因了(TNF)及干擾素lp(IFN-lp)等細胞因子刺激后，iNOS呈誘導(dǎo)性表達增加，其活性可持續(xù)相當(dāng)長時間，催化 NO大量持續(xù)產(chǎn)生，介導(dǎo)廣泛的毒性作用［1，2］。在氧化應(yīng)激造成的肝損傷中，iNOS的表達水平與肝細胞壞死程度呈正相關(guān)，提示iNOS的活化及表達增強與肝臟損傷有關(guān)［4］。

我們建立了肝硬化大鼠模型，并采取不同措施處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組大鼠術(shù)后肝組織中iNOS水平均低于術(shù)前造模成功時，提示iNOS高表達參與了肝硬化的形成。各組大鼠術(shù)后，隨時間推移，iNOS表達逐步下降，但A組下降幅度均B、C組緩慢，術(shù)后1～4周仍高于余兩組，至術(shù)后8周，三組iNOS表達達到谷值，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。推測PVA技術(shù)是術(shù)后4周內(nèi)A組大鼠肝組織iNOS高表達或下降緩慢的主要因素，與大鼠肝細胞損害密切相關(guān)。可能是PVA后，門靜脈處動脈血高壓灌注，為緩和PVA后的門脈高壓，有舒張血管平滑肌作用的化學(xué)分子如NO合成增加，而iNOS是合成NO重要的酶;而術(shù)后8周大鼠肝臟對PVA導(dǎo)致的血流動力學(xué)改變逐漸適應(yīng)，PVA后門靜脈內(nèi)徑、壓力、血流速度、血流量等指標(biāo)處于高位的穩(wěn)定狀態(tài)，iNOS生成減少，肝細胞損傷逐漸減輕。NO具有脂溶性，可直接彌散入鄰近血管平滑肌細胞中，引起血管平滑肌舒張，擴張血管，這一點與大鼠PVA后肝臟血流動力學(xué)的自限穩(wěn)定性密切相關(guān)［12，13］。

綜上，PVA+PCS可上調(diào)肝硬化大鼠肝臟組織中iNOS的水平，但這種變化主要集中在術(shù)后4周內(nèi)。4周后，肝臟對新的血流動力學(xué)改變適應(yīng)并達到穩(wěn)態(tài)，PVA造成的肝損害得到緩解。然而，本實驗結(jié)果還需遠期觀察進一步證實，PVA術(shù)后還應(yīng)觀察門靜脈長期高壓血流灌注對肝臟微循環(huán)的不利影響，對肝間質(zhì)纖維增生的影響等，并研究相應(yīng)的預(yù)防控制措施。

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