四川省女性ERα基因多態(tài)性與乳腺癌風(fēng)險關(guān)系的病例對照研究

曹蘭青，李 卉，劉 莉，王 瓊，李冬鋒，齊亞娜，李 卉△，李佳圓

(1．成都市婦女兒童中心醫(yī)院，成都610041;2．四川省腫瘤醫(yī)院，成都610041;3．四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，成都610041)

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與女性體內(nèi)雌激素暴露密切相關(guān)。雌二醇(estradiol，E2)通過與廣泛分布在乳腺細(xì)胞核內(nèi)的雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合，促進(jìn)乳腺細(xì)胞和組織的增殖分化。ER在乳腺組織的雌激素應(yīng)答反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)人類正常乳腺組織ERα表達(dá)或功能的改變可能會影響乳腺癌發(fā)生風(fēng)險［1］。XbaⅠ(rs9340799)、PvuⅡ(rs2234693)是人群研究較為關(guān)注的ERα基因多態(tài)性位點(diǎn)，均位于ERα基因第1內(nèi)含子內(nèi)，分別在第2外顯子上游351bp和397bp處發(fā)生A/G(x/X)、C/T(P/p)基因突變［2］。有研究者認(rèn)為上述基因突變可能會影響乳腺細(xì)胞ERα基因外顯子區(qū)域mRNA選擇性剪接，從而改變ERα蛋白質(zhì)功能［3］。目前國內(nèi)外關(guān)于XbaⅠ、PvuⅡ基因多態(tài)性與乳腺癌患病風(fēng)險的人群研究結(jié)論尚不一致［4-13］。因此本研究采用病例對照研究設(shè)計(jì)探討四川漢族女性XbaⅠ、PvuⅡ基因多態(tài)性與乳腺癌患病風(fēng)險的關(guān)系，并進(jìn)一步分析二者的聯(lián)合作用。

1 對象及方法

1．1 研究對象

2010年10月至2012年7月，采用便利抽樣收集來源于四川省腫瘤醫(yī)院經(jīng)組織病理學(xué)診斷的原發(fā)性乳腺癌新發(fā)病例。對照組來源于成都市婦女兒童醫(yī)學(xué)中心的健康體檢女性。調(diào)查對象均簽署知情同意書。

病例組:納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡為30～70歲;(2)居住于四川省10年以上。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者;(2)精神疾病患者;(3)內(nèi)分泌疾病患者。

對照組:納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡為30～70歲;(2)均居住于四川省10年以上。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有放射線等職業(yè)暴露史者;(2)惡性腫瘤患者;(3)內(nèi)分泌疾病患者;(4)生殖系統(tǒng)疾病患者;(5)精神疾病患者。

1．2 調(diào)查內(nèi)容

采用問卷調(diào)查收集研究對象的一般人口學(xué)特征、身高、體重、月經(jīng)史、生育史、雌激素藥物服用史等常見乳腺癌危險因素信息。

1．3 基因型檢測

PCR反應(yīng):采用EDTA抗凝管收集研究對象的外周靜脈血5ml。采用天根生化科技(北京)有限公司全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。采用限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)檢測XbaⅠ(rs9340799)、PvuⅡ(rs2234693)基因多態(tài)性。目的基因擴(kuò)增采用巢式PCR技術(shù)，利用Primer Premier 5．0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)PCR引物。外側(cè)引物:上游5-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3;下游5-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3。內(nèi)側(cè)引物:上游5-AGGCTGGGCTCAAACTACAG-3’，下游 5-CTCTGGGAGATGCAGCAGAT-3’。引物設(shè)計(jì)參照陸旭［9］、宋傳貴［14］等的研究。內(nèi)、外側(cè)PCR反應(yīng)體系總量均為 25μl，包括 1μl模板(0．1ng/μl)，1μl前引物(10μmol/L)，1μl后引物(10μmol/L)，12．5μl 2 × Taq PCR master Mix(含染料)，9．5μl RNase-free water。引物由北京 invitrogen英杰生命技術(shù)公司合成，其他試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。外側(cè)PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3分鐘，95℃變性30秒，60．9℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環(huán)30次，最終72℃延伸10分鐘。內(nèi)側(cè)PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，54．6℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環(huán)30次，最終72℃延伸7分鐘。

PCR產(chǎn)物酶切:采用 XbaⅠ內(nèi)切酶(1U/μl)、PvuⅡ內(nèi)切酶(1U/μl)對目的位點(diǎn)進(jìn)行酶切。酶切體系包括:31μl酶切體系，包括10μlPCR產(chǎn)物、1μl XbaⅠ或 PvuⅡ內(nèi)切酶(1U/μl)、2μl10 × Buffer Tango或Buffer G、18μl滅菌超純水。所有試劑均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。將配制好的酶切體系置于37℃恒溫水浴箱內(nèi)酶切4至16小時，取出后滴加1．31μl0．5MEDTA 終止反應(yīng)。

瓊脂糖凝膠電泳:配制1．5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行凝膠電泳。取10μl酶切反應(yīng)產(chǎn)物和2μl溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合后，加入點(diǎn)樣孔內(nèi)，100V恒壓電泳40分鐘，凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察結(jié)果。

基因型判定:XbaⅠ電泳結(jié)果僅出現(xiàn)一條316bp的條帶，為野生純合型(xx);存在615bp和316bp兩條帶，為突變雜合型(Xx);僅出現(xiàn)一條615bp的條帶，為突變純合型(XX)，見圖1。PvuⅡ電泳結(jié)果僅出現(xiàn)一條615bp的條帶，為野生純合型(PP);存在615bp和271bp，344bp三條帶，為突變雜合型(Pp);僅出現(xiàn)271bp和344bp兩條帶，為突變純合型(pp)，見圖2。

1．4 質(zhì)量控制

隨機(jī)抽取5%研究對象于調(diào)查兩周后重新進(jìn)行問卷復(fù)核，兩次回答一致率為90%。隨機(jī)抽取10%的樣本進(jìn)行基因型重復(fù)檢測，重測結(jié)果一致率為100%。PCR片斷經(jīng)DNA測序證明無誤。

1．5 統(tǒng)計(jì)分析

采用 Epidata3．0建立數(shù)據(jù)庫。采用 Spss17．0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用頻數(shù)及構(gòu)成比描述XbaⅠ、PvuⅡ基因型及等位基因的分布，并檢驗(yàn)對照組基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。將本次研究樣本人群的XbaⅠ、PvuⅡ基因型分布與Hapmap數(shù)據(jù)庫中國人群數(shù)據(jù)進(jìn)行比對。采用χ2檢驗(yàn)比較病例組與對照組乳腺癌危險因素的分布差異，篩選出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的協(xié)變量。檢驗(yàn)

圖1 XbaⅠ各基因型電泳圖

2 結(jié)果

2．1 乳腺癌病例組和對照組一般情況及常見危險因素的組間比較

本次研究共納入病例221例，對照252例。病例組平均年齡(48．25±10．04)歲，對照組平均年齡為(47．52 ±9．31)歲，年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0．83，P=0．41)。病例組絕經(jīng)前161例(63．9%)，絕經(jīng)后水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0．05。采用非條件多因素 logistic回歸評價XbaⅠ、PvuⅡ基因多態(tài)性與乳腺癌患病風(fēng)險的關(guān)系。采用分層分析估計(jì)基因與基因間的聯(lián)合效應(yīng)。按照絕經(jīng)狀態(tài)進(jìn)行亞組分析。91 例(36．1%);對照組絕經(jīng)前 130 例(58．8%)，絕經(jīng)后91例(41．2%);經(jīng)檢驗(yàn)，絕經(jīng)狀態(tài)在病例對照組間分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1．28，P=0．26)。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示總?cè)巳褐?，文化程度、家庭人均月收入、職業(yè)、BMI、初產(chǎn)年齡、哺乳、活產(chǎn)數(shù)等變量組間分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)(表1)。絕經(jīng)前后亞組危險因素篩選結(jié)果詳見表1。

圖2 PvuⅡ各基因型電泳圖

表1 乳腺癌一般危險因素變量篩選結(jié)果

表2 XbaⅠ、PvuⅡ基因多態(tài)性與乳腺癌患病風(fēng)險的關(guān)系

表3 XbaⅠ、PvuⅡ?qū)θ橄侔┗疾★L(fēng)險聯(lián)合作用的分層分析結(jié)果

2．2 XbaⅠ、PvuⅡ基因型分布與比較

對照組XbaⅠ、PvuⅡ基因型頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(Xba Ⅰ:χ2=0．001，P=0．98;Pvu Ⅱ:χ2=1．23，P=0．27)。Hapmap 數(shù)據(jù)庫中中國人群XbaⅠ各基因型攜帶率分別為0．65(xx)、0．25(Xx)和 0．10(XX);Pvu Ⅱ各基因型攜帶率為0．20(PP)、0．40(Pp)和 0．40(pp)，與本次研究樣本人群中基因型分布基本一致。多因素Logistic回歸結(jié)果顯示，在總?cè)巳?、絕經(jīng)前及絕經(jīng)后女性中，各位點(diǎn)以野生純和型為參照，突變雜合型及突變純和型與乳腺癌風(fēng)險無關(guān)(P＞0．05)。顯性遺傳模型(Xx+XX vs．xx;Pp+pp vs．PP)也未發(fā)現(xiàn) XbaⅠ、PvuⅡ突變等位基因與乳腺癌患病風(fēng)險的關(guān)系(P ＞0．05)(表2)。

2．3 XbaⅠ、PvuⅡ基因多態(tài)性聯(lián)合作用分析結(jié)果

多因素Logistic回歸結(jié)果顯示，以xxPP野生基因型組合為參照，在總?cè)巳褐校粩y帶p等位基因與乳腺癌患病風(fēng)險無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(OR=0．46，95%CI:0．19～1．10)，而只攜帶 X等位基因能明顯降低乳腺癌患病風(fēng)險(OR=0．31，95%CI:0．11～0．90)，其效應(yīng)大小與同時攜帶X、p等位基因效應(yīng)接近(OR=0．39，95%CI:0．15～1．00)。在絕經(jīng)前亞組中，只攜帶 X 等位基因(OR=0．12，95%CI:0．03～0．54)以及 X、p 聯(lián)合暴露(OR=0．25，95%CI:0．07～0．89)均能降低乳腺癌風(fēng)險。(詳見表3)。

3 討論

XbaⅠ、PvuⅡ位點(diǎn)存在于ERα第一內(nèi)含子內(nèi)，并不直接參與ERα基因轉(zhuǎn)錄翻譯過程。Maruyama等［15］將1．3kbp ERα基因序列插入螢光素酶報告基因載體(pGL3)中，發(fā)現(xiàn)攜帶x等位基因的熒光素酶活性高于 X等位基因。Herrington［16］等發(fā)現(xiàn) P等位基因與ERα蛋白髓細(xì)胞瘤(B-myb)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)暴露有關(guān)，可提高下游外顯子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性。

本次研究在總?cè)巳骸⒔^經(jīng)前及絕經(jīng)后女性中未觀察到XbaⅠ、PvuⅡ基因多態(tài)性影響乳腺癌患病風(fēng)險的獨(dú)立效應(yīng)。這與此前來自中國和歐洲的部分人群研究結(jié)論一致［2，4-8］。但也有研究觀察到乳腺癌患病風(fēng)險與XbaⅠ基因多態(tài)性的關(guān)系。陸旭［9］等在中國北方漢族女性中、Shin［10］等在韓國女性中，Andersen［11］在挪威女性中均發(fā)現(xiàn) X等位基因攜帶者乳腺癌患病風(fēng)險明顯降低。此外，有部分研究觀察到乳腺癌患病風(fēng)險與PvuⅡ基因多態(tài)性的關(guān)系。來自上海［12］和日本［13］的的大樣本病例對照研究均發(fā)現(xiàn)，P等位基因?qū)θ橄侔┑谋Ｗo(hù)作用。由此可見，XbaⅠ、PvuⅡ基因多態(tài)性與乳腺癌患病風(fēng)險關(guān)系在各人種中仍得到不同的結(jié)論。研究間結(jié)論不一致的原因可能與各研究樣本量差異和樣本代表性有關(guān)。國內(nèi)外多數(shù)人群研究發(fā)現(xiàn)的XbaⅠ、PvuⅡ易感基因型具有臨界風(fēng)險效應(yīng)(OR＜2，OR 95%CI下限接近1)，說明這兩個位點(diǎn)多態(tài)性對乳腺癌風(fēng)險的貢獻(xiàn)較弱。

本研究對兩個位點(diǎn)的協(xié)同作用分析發(fā)現(xiàn)在總?cè)巳杭敖^經(jīng)前人群中，與攜帶xxPP野生基因型組合相比，只攜帶X等位基因能明顯降低乳腺癌患病風(fēng)險，其效應(yīng)與同時攜帶X、p等位基因非常接近。這提示X等位基因?qū)θ橄侔┗疾★L(fēng)險具有保護(hù)效應(yīng)，但兩位點(diǎn)間可能并不存在交互效應(yīng)。本研究觀察到X等位基因的保護(hù)效應(yīng)在絕經(jīng)前女性中更為明顯?？赡艿脑蚴荅Rα參與乳腺細(xì)胞雌激素應(yīng)答調(diào)解，故ERα蛋白表達(dá)或功能的改變對絕經(jīng)前女性影響更大。近年來有研究發(fā)現(xiàn)XbaⅠ、PvuⅡ位點(diǎn)之間存在遺傳連鎖不平衡，且xp單倍體可增高乳腺癌患病風(fēng)險。因此，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)行連鎖不平衡及單體型分析，探討XbaⅠ、PvuⅡ?qū)χ袊匀橄侔┗疾★L(fēng)險影響的作用模式，更加全面地揭示這兩個位點(diǎn)與乳腺癌患病風(fēng)險的關(guān)系。

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