搜風(fēng)祛痰法對ApoE基因敲除小鼠主動脈易損斑塊炎癥反應(yīng)及PPARγ基因表達(dá)的影響*

安 毅 宮麗鴻 魏偉超

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110000；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000）

動脈粥樣硬化（AS）是發(fā)生在大中型動脈壁的炎癥性疾?。?］，作為心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)與心血管事件的發(fā)生密不可分。過氧化體增殖物激活型受體（PPAR），已成為近幾年動脈粥樣硬化的研究熱點(diǎn)，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，PPAR參與脂質(zhì)代謝、炎癥及動脈粥樣硬化［2］。PPARγ作為PPAR這一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員的表型之一，研究最為深入。PPARγ的功能廣泛，參與體內(nèi)眾多生理和病理反應(yīng)的調(diào)節(jié)，如糖代謝、脂肪代謝及細(xì)胞分化［3］。搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯在臨床上抗動脈粥樣硬化及穩(wěn)定斑塊作用顯著，本研究則在此基礎(chǔ)上觀察其對動脈粥樣硬化ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響如何，以及對動脈組織中PPARγ基因表達(dá)的干預(yù)作用，從而探討搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯抗AS發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 ApoE（-/-）小鼠和正常C57BL/6 J小鼠，6～8 周齡，SPF 級，體質(zhì)量 18～20 g（北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)并培育成功）。

1.2 藥物與試劑 穩(wěn)斑湯組成：全蝎10 g，蜈蚣1條，地龍 15 g，陳皮 15 g，半夏 15 g，白術(shù) 15 g，水蛭 15 g。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局提供，加工制成含生藥2 g/mL中藥濃縮液備用；阿托伐他?。ㄝx瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20051409，規(guī)格：20 mg）。HE染色主要試劑：蘇木精染液、伊紅染液等（購自北京博奧森生物科技有限公司）；兩步法RT-PCR試劑盒（購自北京全式金生物技術(shù)有限公司）；DNA maker（購自北京全式金生物技術(shù)有限公司）；Trizol（購自invitrogen公司）；引物（由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司代為合成）。

1.3 造模與分組 造模小鼠飼以含脂肪21%、膽固醇0.15%的高脂飼料（60Coγ滅菌照射處理），根據(jù)文獻(xiàn)［4］同時(shí)對小鼠進(jìn)行足底電流刺激，13周后，隨機(jī)處死4只，去主動脈根部，HE染色觀察基礎(chǔ)AS硬化程度，確定造模成功。ApoE基因敲除小鼠60只隨機(jī)分為5組，模型組、西藥組及穩(wěn)斑湯低、中、高劑量組各12只。正常C57BL/6 J小鼠12只正常飼料喂養(yǎng)13周，設(shè)為空白組。

1.4 給藥方法 根據(jù)成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體質(zhì)量折算系數(shù)9.0折算成小鼠用量：穩(wěn)斑湯低劑量組 61.75 g/（kg·d），穩(wěn)斑湯中劑量組 123.5 g/（kg·d）， 穩(wěn)斑湯高劑量組 247 g/（kg·d），西藥組予阿托伐他汀0.27 g/（kg·d），正常組與模型組給予生理鹽水0.3 mL/d。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 取材前夜禁食，處死全部小鼠，無菌條件下取出心臟及主動脈，心臟10%甲醛固定，主動脈放在凍存管內(nèi)，置于液氮中，后轉(zhuǎn)移到-80℃保存?zhèn)溆谩Ｖ鲃用}組織病理學(xué)觀察，每組隨機(jī)取5只小鼠，麻醉處死，無菌條件下于主動脈根部取4個(gè)相同切面，生理鹽水沖洗，10%甲醛中性溶液固定，組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度 5 μm，切片行HE染色，光鏡下觀察主動脈的形態(tài)。半定量RT-PCR法測定血管壁PPARγ和TLR4基因表達(dá)?？俁NA抽提按invitogen公司生產(chǎn)的trizol說明書。最后用適量DEPC處理水溶解沉淀RNA樣品，-80℃保存?zhèn)溆?，PPARγ引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司代為合成。GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。操作嚴(yán)格按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及PCR，并且進(jìn)行瓊脂糖電泳，成像記錄。

表1 基因引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（）表示，組間比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠主動脈組織形態(tài)學(xué)改變 見圖1?？瞻讓φ战M：動脈內(nèi)膜附有一層內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞層呈現(xiàn)皺褶狀排列，但排列均勻，表面光滑，未見泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞。模型對照組：血管腔內(nèi)可見明顯的粥樣硬化斑塊出現(xiàn)，斑塊表面附有纖維帽，纖維帽主要由平滑肌細(xì)胞、彈力纖維和膠原組織構(gòu)成，斑塊中央可見大量的脂質(zhì)聚集，斑塊內(nèi)可見大量泡沫細(xì)胞，偶見炎性細(xì)胞浸潤，未出現(xiàn)斑塊的動脈內(nèi)膜區(qū)域嚴(yán)重破損。中藥低劑量組：血管腔內(nèi)可見粥樣硬化斑塊，斑塊面積明顯小于模型對照組，斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量較模型組少，斑塊內(nèi)可見少量泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞，偶見內(nèi)膜殘缺。中藥中劑量組、中藥高劑量組、西藥組：動脈內(nèi)膜大部分較為光滑，偶見內(nèi)膜不全，內(nèi)膜不全區(qū)域可見明顯的脂質(zhì)條紋塊形成，偶見泡沫細(xì)胞聚集，有少量纖維成分交聯(lián)。

圖1 各組小鼠腹主動脈HE染色（100倍）

2.2 各組小鼠腹主動脈PPARγ基因表達(dá)水平 見圖2，表2。各組ApoE基因敲除小鼠半定量RT-PCR結(jié)果表明：與空白組相比，模型組PPAR-γ mRNA表達(dá)水平明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，西藥組和穩(wěn)斑湯各劑量組均能提高PPAR-γ mRNA表達(dá)水平 （P＜0.01）；與西藥組相比，穩(wěn)斑湯高劑量組提高PPAR-γ mRNA表達(dá)水平與其無差異（P＞0.05）。

圖2 PPAR-γ mRNA表達(dá)

表2 各組小鼠腹主動脈組織中PPAR-γ mRNA表達(dá)水平（）

表2 各組小鼠腹主動脈組織中PPAR-γ mRNA表達(dá)水平（）

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

3 討 論

AS作為炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿于AS發(fā)生、發(fā)展及斑塊破裂血栓形成的全過程，是引起動脈壁不穩(wěn)定斑塊及相應(yīng)并發(fā)癥的中心環(huán)節(jié)［5］。在這一過程中大量的炎性因子參與其中，如TNF-α作為重要的炎性介質(zhì)可通過促進(jìn)MMPs表達(dá)，使纖維帽變薄，斑塊趨于不穩(wěn)定，此外，TNF-α還可以通過活化內(nèi)皮細(xì)胞、氧化應(yīng)激、血小板聚集、血栓形成來誘發(fā)ACS的發(fā)生［6］。

大量研究表明PPARγ是一個(gè)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增值的調(diào)節(jié)劑，在巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)，它對炎癥介質(zhì)進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)，抑制炎癥因子的生成及炎癥的形成，抗感染作用廣泛而強(qiáng)大［7］。當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活后，PPARγ表達(dá)水平升高，通過阻止清道夫受體A、可誘導(dǎo)性NO合成酶及明膠酶B等的分泌來減少單核細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α等炎性因子，從而限制慢性炎癥，在斑塊區(qū)發(fā)揮抗炎作用。本研究通過光鏡觀察到中藥各劑量組和西藥組斑塊區(qū)的炎癥反應(yīng)均明顯弱于模型組；動脈粥樣硬化ApoE基因敲除小鼠模型組PPARγ基因僅有少量表達(dá)，并不足以阻止動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，而中藥穩(wěn)斑湯各劑量組及西藥他汀組均能不同程度地增加PPARγ基因表達(dá)（P＜0.01或 P＜0.05），從而使 PPARγ基因活化。

搜風(fēng)祛痰法中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯，其方中搜風(fēng)藥為蟲類，走竄力強(qiáng)，佐以健脾燥濕化痰之藥。全方共奏搜風(fēng)祛痰、祛瘀通絡(luò)之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示：全蝎可增強(qiáng)心肌收縮力、擴(kuò)張血管、抗血栓形成；地龍可激活纖維酶原；蜈蚣擴(kuò)張血管同時(shí)亦可抗心肌缺血；水蛭有較強(qiáng)的抗凝血作用，能改善血液流變學(xué)；陳皮對心血管系統(tǒng)有降脂作用，減少炎癥反應(yīng)、抗血小板聚集；半夏對高脂血癥有治療作用；白術(shù)能夠減輕心肌耗氧、改善心肌血供。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯可以使血管壁PPARγ基因激活，減輕動脈粥樣硬化的炎癥作用，穩(wěn)定易損斑塊。揭示搜風(fēng)祛痰穩(wěn)斑湯對PPARγ的上調(diào)作用，可能是搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯抑制斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用的機(jī)制之一。

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