干擾素-α抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖

龍向淑，宋 方，黃 晶，吳 強(qiáng)

(貴州省人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng) 550002)

干擾素-α抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖

龍向淑，宋 方，黃 晶，吳 強(qiáng)*

(貴州省人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng) 550002)

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)過(guò)度增殖是血管成形術(shù)后再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化及高血壓等血管增殖性疾病的共同病理基礎(chǔ)，有效抑制VSMCs增殖對(duì)上述疾病的防治具有重要的臨床意義。干擾素(Interferon, IFN)具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)等作用，但其對(duì)VSMCs增殖的影響及其機(jī)制尚未完全明確。本研究探討IFN-α對(duì)大鼠VSMCs增殖的影響及其部分機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑(盒)：清潔級(jí)SD大鼠(雌性1只，雄性2只)，體質(zhì)量120～140 g[第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(渝)2012-0003]。IFN-α(北京三元基因工程有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Hyclone公司)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(C1052)(碧云天公司)；100 bp DNA Ladder(北京天根公司)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；PCR擴(kuò)增引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)；P204抗體(Santa Cruz公司)；Western 中分子質(zhì)量蛋白Marker(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組：按文獻(xiàn)[1]的方法進(jìn)行VSMCs培養(yǎng)。取4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分3組，即對(duì)照組(control)、IFN-α干預(yù)組(IFN)和20% FBS+IFN-α組(F+I)；IFN組用終濃度為2×106U/L IFN-α干預(yù)6 h，F(xiàn)+I組予20% FBS刺激12 h后與IFN組同步加IFN-α，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)：按文獻(xiàn)[2]的方法操作。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：按試劑盒(C1052)說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)：常規(guī)提取總RNA和反轉(zhuǎn)錄，定量PCR擴(kuò)增目的基因。

1.6 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)：按文獻(xiàn)[2]的方法操作。

表1 引物序列Table 1 The sequences of primers

2 結(jié)果

2.1 IFN-α對(duì)VSMCs增殖及細(xì)胞周期的影響：與對(duì)照組比較，IFN組、F+I組的MTT吸光度A值降低(P<0.05)；IFN和F+I組的G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少(P<0.05)(表2)。

2.2 IFN-α對(duì)P204 mRNA及蛋白表達(dá)的影響：IFN組、F+I組的P204 mRNA及蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高(P<0.05)(圖1，表2)。

3 討論

VSMCs增殖是血管增殖性疾病重要的病理改變。VSMCs增殖是多階段及多因子參與的調(diào)節(jié)過(guò)程，抑制VSMCs增殖、遷移以及表型轉(zhuǎn)化等是血管增殖性疾病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

IFN是一組具有抗病毒、抗增殖、影響細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等功能的活性細(xì)胞因子家族。IFN與相應(yīng)受體結(jié)合，誘導(dǎo)一系列IFN誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)而發(fā)揮其抗病毒及影響細(xì)胞增殖等生物學(xué)效應(yīng)。IFN的抗病毒及免疫調(diào)節(jié)功效已明確，而其調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，如抗增殖、促凋亡或存活、促進(jìn)衰老和分化及抑制血管生成的作用及機(jī)制尚存在爭(zhēng)議。P204(interferon-inducible protein 204, P204)是IFN誘導(dǎo)蛋白P200家族的鼠類蛋白成員。近期研究[2]表明，IFN-α可促進(jìn)P204表達(dá)而抑制大鼠主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞增殖。本結(jié)果顯示， IFN-α干預(yù)可降低VSMCs細(xì)胞活力，阻滯或延緩VSMCs細(xì)胞周期由G0/G1期進(jìn)入S期，在此過(guò)程中，伴P204 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)；同時(shí)，IFN-α可抑制胎牛血清的促VSMCs增殖作用，同樣觀察到P204 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，更進(jìn)一步證實(shí)，IFN-α可通過(guò)上調(diào)P204表達(dá)抑制VSMCs增殖。

表2 IFN-α對(duì)VSMCs 增殖和P204表達(dá)的影響Table 2 Effect of IFN-α on proliferation of VSMCs and expression of P204(±s,n=3)

*P<0.05 compared with control.

IFN.IFN-α induction group; F+I.20% FBS+ IFN-α group; control.control group圖1 干擾素-α對(duì)P204 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig 1 Effect of IFN-α on expression of P204 mRNA and protein in VSMCs

綜上所述， IFN-α可通過(guò)上調(diào)P204表達(dá)抑制鼠VSMCs增殖，為血管增殖性疾病的研究和防治展示了新的前景。

[1] 宋方,吳強(qiáng),陸德琴,等.一套系統(tǒng)培養(yǎng)鼠主動(dòng)脈血管壁細(xì)胞簡(jiǎn)單可靠的方法[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2011,19:361- 366.

[2] 宋方,吳強(qiáng),潭洪文,等.IFNα通過(guò)p204抑制大鼠主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞增殖[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2012, 32:1431- 1436.

2013- 09- 26

2013- 11- 22

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金(No. 黔省專合字[2009]30號(hào))

*通信作者(correspondingauthor)： gzgywq@126.com

1001-6325(2014)08-1106-02

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