程序性壞死機(jī)制與缺血再灌注損傷

葉周恒，劉文武，孫學(xué)軍

(第二軍醫(yī)大學(xué) 潛水醫(yī)學(xué)教研室， 上海 200433)

程序性壞死機(jī)制與缺血再灌注損傷

葉周恒，劉文武，孫學(xué)軍*

(第二軍醫(yī)大學(xué) 潛水醫(yī)學(xué)教研室， 上海 200433)

程序性壞死是一種具有可調(diào)控的信號(hào)傳導(dǎo)通路的細(xì)胞壞死方式。多種刺激可導(dǎo)致程序性壞死的發(fā)生，復(fù)合體Ⅰ、復(fù)合體Ⅱ和RIP1-RIP3壞死體是通路中的信號(hào)分子，而Necstatin-1是程序性壞死的特異性阻斷劑。程序性壞死可能是缺血再灌注損傷中細(xì)胞死亡的重要方式。

程序性壞死；受體相互作用蛋白激酶1；受體相互作用蛋白激酶3

壞死是一種重要的細(xì)胞死亡方式，生理和病理?xiàng)l件下均可發(fā)生，主要表現(xiàn)為細(xì)胞器水腫、活性氧和胞內(nèi)鈣升高、ATP含量下降以及細(xì)胞器和細(xì)胞膜最終破裂。過(guò)去認(rèn)為壞死是不可調(diào)控的，因此，相對(duì)于凋亡而言，壞死的研究較少。然而，最近發(fā)現(xiàn)某些特殊的細(xì)胞中，給予特定的誘導(dǎo)劑，同時(shí)抑制凋亡通路后，可發(fā)生具有一定分子基礎(chǔ)的、可調(diào)控的細(xì)胞壞死，這種細(xì)胞死亡方式被稱之為程序性壞死。程序性壞死在病毒感染[1]、肝和腎的缺血再灌注損傷[2-3]等疾病中都可發(fā)揮重要作用。程序性壞死是一種新的細(xì)胞死亡方式，研究程序性壞死能幫助我們更好的理解許多生理病理過(guò)程并尋找疾病治療的新靶點(diǎn)。

1 程序性壞死的發(fā)現(xiàn)歷程

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的研究中，用顯微攝影技術(shù)觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)相同的TNF刺激能誘導(dǎo)不同細(xì)胞發(fā)生不同類(lèi)型的細(xì)胞死亡[4]。TNF誘導(dǎo)F17細(xì)胞發(fā)生典型的凋亡，卻也誘導(dǎo)L-M細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞壞死。NF-κB信號(hào)通路中的受體相互作用蛋白激酶(receptor interaction protein kinase, RIP)可能是這種新通路中的信號(hào)分子。死亡受體FAS也能引起這種壞死，且不依賴caspase活性，卻需RIP和FAS蛋白相關(guān)死亡區(qū)域(Fas-associated protein with death domain, FADD)的參與[5]。小分子抑制劑necrostatin-1，能特異性抑制這種特殊的細(xì)胞死亡方式[6]。這種具有可調(diào)控的信號(hào)通路的細(xì)胞死亡過(guò)程被命名為程序性壞死(Necroptosis)。Necrostatin-1的分子靶點(diǎn)是受體相互作用蛋白1(RIP1)[7]，necrostatin-1與RIP1的相互結(jié)合可使RIP1不激活[8]。此外，受體相互作用蛋白3(RIP3)在程序性壞死通路中的也具有重要作用[9]。混合線性激酶功能域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)，可能是RIP3下游分子蛋白[10]。此外，Akt[11]和ERK[12]通路也可能參與了程序性壞死。

2 程序性壞死的機(jī)制

2.1 程序性壞死的誘導(dǎo)

各種相應(yīng)配體可以與腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)、CD95(也稱FAS)、腫瘤壞死因子受體2(tumor necrosis factor receptor 2, TNFR2)、TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體1和2(TRAILR1和TRAILR2)結(jié)合誘導(dǎo)程序性壞死[4-5]。此外， 谷氨酸鹽[12]等也可通過(guò)未知分子機(jī)制引起程序性壞死。這些因素誘導(dǎo)的程序性壞死中，對(duì)TNFR1介導(dǎo)的程序性壞死進(jìn)行的研究最為系統(tǒng)深入。因此雖然不排除不同受體介導(dǎo)的程序性壞死各自存在特殊的分子機(jī)制，下文以TNF誘導(dǎo)的程序性壞死為主，介紹程序性壞死的信號(hào)傳導(dǎo)通路(圖 1)。

圖1 程序性壞死分子機(jī)制Fig 1 Molecular mechanism ofnecroptosis

2.2 RIP1

RIP1在NF-κB通路中研究較多。已有研究表明，RIP1可以看做該通路中一個(gè)處于金字塔頂端的蛋白[5]。當(dāng)RIP1被泛素化時(shí)，則選擇NF-κB通路介導(dǎo)細(xì)胞生存；當(dāng)RIP1去泛素化，細(xì)胞被迫選擇死亡機(jī)制時(shí)，會(huì)出現(xiàn)凋亡或者程序性壞死[5]。因此RIP1泛素化是決定細(xì)胞壞死和存活的重要調(diào)節(jié)步驟。RIP1由3個(gè)功能區(qū)域組成：氨基末端激酶區(qū)域、中間區(qū)域和羧基末端死亡區(qū)域。程序性壞死過(guò)程中，RIP1的絲氨酸14/15，絲氨酸161等位點(diǎn)可發(fā)生自身磷酸化，這些位點(diǎn)都位于RIP1的氨基末端激酶區(qū)域[7]，提示RIP1氨基末端激酶區(qū)域在程序性壞死中起到了重要作用?；罨乃劳鍪荏w募集RIP1，導(dǎo)致RIP1泛素化。這種泛素化狀態(tài)由凋亡胞內(nèi)抑制劑(inhibitor of apoptosis protein, IAP)維持，當(dāng)IAP的作用去除后，RIP1即可被去泛素化。藥物抑制cIAPs或基因敲除cIAPs，可抑制RIP1的泛素化，從而促進(jìn)程序性壞死[13]。RIP1處于復(fù)合體Ⅰ中，復(fù)合體Ⅰ由活化的TNFR1聚集 RIP1、凋亡胞內(nèi)抑制劑1(cIAP1)、cIAP2、TNFR相關(guān)因子2(TRAF2)，TRAF5，和TNFR結(jié)合死亡區(qū)域(TRADD)一起組成[8]。

2.3 RIP3

RIP3與RIP1具有共同的氨基末端激酶區(qū)域和羧基末端激酶RIP同型作用功能域(RIP homotypic interaction motif, RHIM)，不同的是RIP3不參與NF-κB通路。去泛素化的RIP1能募集RIP3，與TRADD、FADD和caspase-8一起組成復(fù)合體Ⅱ[14]，后者也被稱為死亡激發(fā)信號(hào)復(fù)合物(death-inducing signaling complex, DISC)。RIP1的去泛素化狀態(tài)是復(fù)合體Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)合體Ⅱ的重要因素[14]。去泛素化的RIP1能激活復(fù)合體Ⅱ中的caspase-8，后者則黏附并使RIP1和RIP3失活，同時(shí)黏附并活化BID和caspase-3，觸發(fā)caspase依賴的細(xì)胞凋亡。然而，當(dāng)caspase激活被阻斷，復(fù)合體Ⅱ?qū)?dòng)促壞死信號(hào)[5]。

2.4 RIP1-RIP3壞死體

Caspase被抑制后，RIP3通過(guò)RIP蛋白家族共同的氨基末端RHIM區(qū)域結(jié)合成超分子復(fù)合體，稱為RIP1-RIP3壞死體[15]。RIP1和RIP3相互結(jié)合后，去泛素化的RIP1發(fā)生自身磷酸化，RIP3又發(fā)生直接或者間接的第199位絲氨酸磷酸化[5]，引起程序性壞死[9-14]。Necrostatin-1可破壞RIP1與RIP3的結(jié)合，阻斷程序性壞死[14]。

MLKL由氨基末端卷曲(Coiled-Coil，CC)區(qū)域和羧基末端激酶樣區(qū)域組成，但缺少與其他蛋白結(jié)合的P環(huán)和磷酸化活性。MLKL缺失的細(xì)胞在程序性壞死過(guò)程中停留在壞死體環(huán)節(jié)，而RIP3可磷酸化MLKL，誘導(dǎo)致程序性壞死。因此，MLKL可能是壞死體的核心組成部分。Necrosulfonamide可以通過(guò)抑制MLKL活性阻斷程序性壞死[10]。

需指出的是，RIP1或者RIP3可能都不是程序性壞死的必需蛋白，因?yàn)榍贸齊IP1的鼠類(lèi)胚胎成纖維細(xì)胞在TNF誘導(dǎo)下仍可發(fā)生程序性壞死[16]。

RIP1-RIP3壞死體下游引起細(xì)胞最終壞死的機(jī)制比較復(fù)雜，如：通過(guò)氧化應(yīng)激途徑，增加胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)導(dǎo)致程序性壞死[17]；通過(guò)多聚ADP核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose) polymerase-1, PARP1][18]和線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor, AIF)途徑導(dǎo)致DNA斷裂導(dǎo)致程序性壞死等[19]。

3 程序性壞死與缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷過(guò)程中細(xì)胞具有不同的死亡方式，包括壞死、凋亡和自噬等。程序性壞死的發(fā)現(xiàn)為細(xì)胞死亡方式添加了新的可能。程序性壞死通路抑制劑Nec-1不僅可以在體外阻止細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，也有結(jié)果表明可以增強(qiáng)鼠大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注后的神經(jīng)恢復(fù)。這表明體內(nèi)缺血再灌注延遲損傷中程序性壞死是細(xì)胞死亡的重要方式，這也為研制開(kāi)發(fā)神經(jīng)保護(hù)藥物以減少細(xì)胞壞死提供了新的靶點(diǎn)[6]。雖然神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷后細(xì)胞以發(fā)生自噬為主，但這可能因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)皿中缺乏體內(nèi)缺血再灌注后出現(xiàn)的其他一些影響因素，如TNF-α、FasL等誘導(dǎo)程序性壞死的配基[20]。

上述實(shí)驗(yàn)表明，離體細(xì)胞缺血再灌注中細(xì)胞死亡的方式主要以自噬為主；而在體環(huán)境中細(xì)胞因所處環(huán)境更復(fù)雜，參與細(xì)胞死亡的因素更多，可能細(xì)胞的壞死以程序性壞死為主。在視網(wǎng)膜缺血模型中，Nec-1預(yù)處理組與對(duì)照組相比可有效保護(hù)視網(wǎng)膜，且在缺血后再給予Nec-1依然有明顯保護(hù)作用[21]。神經(jīng)元缺血模型中，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用Nec-1和凋亡抑制藥(HNG，Gly14-humanin)后神經(jīng)保護(hù)效果較好[22]。有關(guān)缺血再灌注損傷與程序性壞死的研究仍然較少，且根據(jù)不同的器官中細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的組成不同，Nec-1的療效也各有差異[23]，缺血再灌注損傷與程序性壞死的研究還有待進(jìn)一步深入。

4 結(jié)語(yǔ)和展望

程序性壞死是一種新的細(xì)胞死亡方式，已有證據(jù)表明它在免疫調(diào)節(jié)、組織損傷和癌癥進(jìn)展等方面具有重要作用。程序性壞死可被多種刺激誘導(dǎo)，也可被necstatin-1抑制。RIP1和RIP3壞死體是程序性壞死中的重要參與者。目前，程序性壞死的分子機(jī)制尚未完全清楚，如FADD在其中的作用并不清晰。程序性壞死的研究必然會(huì)為疾病治療發(fā)現(xiàn)更多的治療靶點(diǎn)。

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Molecular mechanism of necroptosis and its effect in IR injury

YE Zhou-heng, LIU Wen-wu, SUN Xue-jun*

(Dept. of Diving Medicine, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

Necroptosis is a special cell necrosis that is capable of being regulated through particular molecular mechanism. Multiple stimuli could induce necroptosis, complex Ⅰ, complex Ⅱ and RIP1-RIP3 necrosome are critical participants in the necroptosis. Also, necrostatin-1 is a special and potent small-molecular inhibitor of necroptosis. Necroptosis could be an important alternative for cell death in ischemia-reperfusion injury.

necroptosis; receptor interaction protein kinase 1; receptor interaction protein kinase 3

2013-06-13

2013-09-24

*通信作者(correspondingauthor)： sunxjk@hotmail.com

1001-6325(2014)03-0414-04

短篇綜述

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