苯丙酸諾龍促進(jìn)胰島NIT-1細(xì)胞Nampt表達(dá)和胰島素分泌

陳潔潤，吳雅婷，馮 喬，沈 旺，馮樂平

(桂林醫(yī)學(xué)院 生物技術(shù)學(xué)院， 廣西 桂林 541004)

研究論文

苯丙酸諾龍促進(jìn)胰島NIT-1細(xì)胞Nampt表達(dá)和胰島素分泌

陳潔潤，吳雅婷，馮 喬，沈 旺，馮樂平*

(桂林醫(yī)學(xué)院 生物技術(shù)學(xué)院， 廣西 桂林 541004)

目的探討雄性激素苯丙酸諾龍?jiān)谘趸瘧?yīng)激條件下對胰島細(xì)胞的作用，為2型糖尿病治療提供理論依據(jù)。方法將培養(yǎng)的NIT-1細(xì)胞按不同葡萄糖濃度(5.6、11.1、16.7和27.6 mmol/L)分為4組，分別用10 μg/mL苯丙酸諾龍?zhí)幚?8 h，之后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；用Western blot 檢測Nampt和FOXO1蛋白表達(dá)和用放射免疫法測定細(xì)胞胰島素分泌。結(jié)果用苯丙酸諾龍?zhí)幚?8 h后，1)低糖條件下細(xì)胞G0/G1期阻滯明顯改善(Plt;0.01)；2)高糖條件下細(xì)胞G2/M期阻滯得到緩解(Plt;0.01)；3)高糖氧化應(yīng)激狀態(tài)下，苯丙酸諾龍促進(jìn)胰島細(xì)胞Nampt表達(dá)(Plt;0.05)和抑制非磷酸化的FOXO1蛋白表達(dá)(Plt;0.01)，細(xì)胞分泌胰島素增加。結(jié)論苯丙酸諾龍能夠在高濃度葡萄糖條件下改善胰島細(xì)胞生存狀況和促進(jìn)胰島素分泌，這些效應(yīng)可能與促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Nampt表達(dá)和抑制FOXO1密切相關(guān)。

胰島NIT-1細(xì)胞； 苯丙酸諾龍； Nampt； FOXO1; 細(xì)胞周期

最近研究表明，睪丸激素缺乏能夠降低組織胰島素受體表達(dá)和減少葡萄糖氧化，然而這種機(jī)制并不明確[1]。去勢大鼠給予一定的睪丸酮可以改善上述狀況，說明男性性激素水平改變與胰島素抵抗和2型糖尿病密切相關(guān)[2-3]。由此可以推斷，雄激素可能與胰島素信號傳導(dǎo)途徑存在密切聯(lián)系。本研究應(yīng)用苯丙酸諾龍作用小鼠胰島NIT-1細(xì)胞株，觀察雄激素苯丙酸諾龍對NIT-1細(xì)胞內(nèi)煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampt)和叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box protein 1, FOXO1)表達(dá)的關(guān)系，探討雄性激素對胰島細(xì)胞的作用，試圖揭示2型糖尿病中的胰島β細(xì)胞在胰島素抵抗過程中的發(fā)病機(jī)理，為糖尿病治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

胰島β細(xì)胞株NIT-1細(xì)胞(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)，苯丙酸諾龍、碘化丙啶PI(Sigma公司)，碘-胰島素放射免疫分析藥盒(北京北方生物技術(shù)研究所)，WIP組織細(xì)胞裂解液、superECL plus western blot超敏發(fā)光液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，Nampt和FoxO1兔抗鼠多克隆一抗、Actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG(H+L)-HRP(Bioworld Technology公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 NIT-1細(xì)胞的培養(yǎng)與分組：取4×105/L的NIT-1細(xì)胞放于直徑3.5 mm平皿中(含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基)，置37 ℃、含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取增殖期細(xì)胞依照培養(yǎng)基不同糖濃度分為以下4組：分別為5.6 mmol/L(低糖)，11.1 mmol/L(對照組)，16.7和27.6 mmol/L(高糖組),每個(gè)糖濃度組分別設(shè)置5復(fù)孔。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測Nampt和FOXO1蛋白表達(dá)：各不同濃度葡萄糖處理組的NIT-1細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS(pH 7.4)漂洗后，加入預(yù)冷RIPA裂解液，將刮取的貼壁細(xì)胞和裂解液混合后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷微量離心管中，超聲波處理30～60 s，4 ℃搖動(dòng)30 min后12 000 r/min離心15 min，收集各組上清液測定總蛋白濃度(BCA蛋白定量試劑盒，按說明書操作)。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后，于4 ℃冰箱中80 mV轉(zhuǎn)PVDF膜1 h，常溫下封閉膜2 h，分別應(yīng)用一抗β-actin抗體(1∶1 000)，Nampt抗體(1∶500)、FOXO1抗體(1∶500)，按1∶200～500比例加入5%疊氮鈉(4 ℃輕搖過夜), 之后應(yīng)用相應(yīng)二抗(羊抗兔IgGHRP, SantaCruz公司產(chǎn)品)稀釋液37 ℃孵育1 h。將化學(xué)發(fā)光底物(按1∶1 混勻)加于PVDF膜上，應(yīng)用Quantity One成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)檢測靶蛋白和β-action雜交圖像的峰面積值，以兩者峰面積值比表示蛋白表達(dá)量(重復(fù)3次取平均值)。蛋白表達(dá)水平(相對值)=待測蛋白吸光度值/β-actin吸光度值。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)PI染色法檢測細(xì)胞周期：取細(xì)胞加入1 mL PBS懸浮細(xì)胞洗滌細(xì)胞，隨渦旋振蕩緩慢滴加9 mL 70%冰乙醇固定細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min后棄冰乙醇，PBS洗滌后，應(yīng)用0.5 mL的100 mg/L的RNase懸浮細(xì)胞，置37 ℃水浴箱中孵育30 min，加入25 μL 1g/L PI染液，避光染色3～5 min后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。軟件分別計(jì)算G1/G0期、S期和G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及細(xì)胞增殖指數(shù)PI=(S期+G2/M期)/(G1/G0期+ S期+G2/M期)。

1.3.4 放射免疫法檢測胰島NIT-1細(xì)胞分泌的胰島素：應(yīng)用苯丙酸諾龍干預(yù)48 h后，收集細(xì)胞上清液到EP管中置于室溫，根據(jù)胰島素檢測試劑盒要求(具體步驟參見說明書)。應(yīng)用GC-1200型γ放射免疫計(jì)數(shù)器(中佳光電儀器分公司)進(jìn)行計(jì)數(shù)，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞樣品上清液中胰島素濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Western blot法檢測NIT-1細(xì)胞中Nampt和FOXO1蛋白表達(dá)

在5.6和27.6 mmol/L葡萄糖條件下，Nampt蛋白表達(dá)均降低，而FOXO1蛋白隨葡萄糖增加表達(dá)升高。苯丙酸諾龍干預(yù)后，細(xì)胞Nampt表達(dá)均增加，高濃度葡萄糖培養(yǎng)時(shí)，Nampt蛋白表達(dá)較對照組增加明顯(Plt;0.01)(圖1)；FOXO1表達(dá)較對照組均明顯減少(Plt;0.01)，當(dāng)葡萄糖≤11.1 mmol/L時(shí)，F(xiàn)OXO1表達(dá)較對照組減少(Plt;0.05)(圖2)。

*Plt;0.01 compared with control圖1 苯丙酸諾龍干預(yù)48 h后各組NIT-1細(xì)胞Nampt蛋白表達(dá)Fig 1 Nampt expression of NIT-1 cells after nandro- lone phenylpropionate intervened 48 hours

2.2 流式細(xì)胞術(shù)PI染色法檢測NIT-1細(xì)胞周期

當(dāng)葡萄糖5.6 mmo/L時(shí)，NIT-1 細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯；當(dāng)葡萄糖分別在16.7和27.6 mmol/L時(shí)，細(xì)胞在G2/M期出現(xiàn)阻滯，苯丙酸諾龍干預(yù)后，G2/M期阻滯狀態(tài)均明顯改善(Plt;0.05，Plt;0.01)(表1)，而這種作用在低糖時(shí)并不明顯。

*Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with control圖2 苯丙酸諾龍干預(yù)48 h各組NIT-1細(xì)胞FOXO1蛋白表達(dá)Fig 2 FOXO1 expression of NIT-1 cells after nandro- lone phenylpropionate intervened 48 hours

2.3 放射免疫法檢測胰島NIT-1細(xì)胞的胰島素分泌水平

當(dāng)葡萄糖在5.6和11.1 mmo/L時(shí)，苯丙酸諾龍干預(yù)后未見胰島素分泌明顯改變；但當(dāng)葡萄糖增加到16.7 mmo/L之后，苯丙酸諾龍干預(yù)使細(xì)胞胰島素分泌明顯增加(Plt;0.01)(表2)。

3 討論

很多疾病由于類固醇激素變化嚴(yán)重影響了機(jī)體外周胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[4]。然而，雄性激素影響胰島β細(xì)胞分泌胰島素的作用機(jī)制目前所知甚少。本研究采用高濃度葡萄糖作用胰島細(xì)胞，模擬糖尿病條件下胰島細(xì)胞可能受到的沖擊，之后應(yīng)用10 μg/mL苯丙酸諾龍對不同糖濃度培養(yǎng)的NIT-1細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，而在高糖氧化應(yīng)激時(shí)細(xì)胞被阻滯在G2/M期，低糖和高糖狀態(tài)均明顯導(dǎo)致NIT-1細(xì)胞增殖指數(shù)降低。應(yīng)用苯丙酸諾龍干預(yù)后，細(xì)胞所發(fā)生的阻滯效應(yīng)均被解除，細(xì)胞增殖指數(shù)也明顯增加。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低糖和高糖培養(yǎng)時(shí)，Nampt蛋白表達(dá)均明顯降低，且隨著葡萄糖濃度在≥16.7 mmol/L時(shí)，F(xiàn)OXO1蛋白表達(dá)增高。應(yīng)用苯丙酸諾龍干預(yù)48 h后，上述兩種條件中的細(xì)胞Nampt表達(dá)均明顯增加，此時(shí)FOXO1蛋白表達(dá)則明顯減少。研究表明，Nampt能夠通過介導(dǎo)NAD的生物合成激活SIRT1，并且在介導(dǎo)NAD生物合成過程中調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞分泌胰島素[5]。在胰島素抵抗過程中，F(xiàn)OXO1不能被Akt磷酸化從胞核排出而積聚在核內(nèi)，從而促進(jìn)細(xì)胞糖脂代謝紊亂[6-7]，本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用苯丙酸諾龍能夠在提高NIT-1細(xì)胞Nampt表達(dá)的同時(shí)，抑制非磷酸化的FOXO1表達(dá)。由此可見，苯丙酸諾龍既能夠增強(qiáng)Nampt表達(dá)，又能夠抑制FOXO1的轉(zhuǎn)錄活性，然而苯丙酸諾龍的這種作用是否是在影響了Nampt表達(dá)之后，才對胰島素信號途徑發(fā)揮作用，還是直接作用了胰島素信號途徑尚待進(jìn)一步研究。

表1 苯丙酸諾龍干預(yù)后各組 NIT-1 細(xì)胞周期中G0/G1期和G2/M期變化

*Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with control.

表2 不同糖濃度條件下苯丙酸諾龍干預(yù)后細(xì)胞分泌胰島素情況

*Plt;0.01 compared with control.

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Benzyl propionate nandrolone enhancesNampt expression and insulin secretion in NIT-1 islet cells

CHEN Jie-run,WU Ya-ting,FENG Qiao,SHEN Wang, FENG Le-ping*

(Dept. of Biotechnology, Guilin Medical University, Guilin 541004, China)

ObjectiveTo discuss the effects of nandrolone styrene acrylic acid on islet cells under the condition of oxidative stress for the theoretical basis of the treatment of type 2 diabetes.MethodsNIT-1 cell were divided into four groups with different concentrations of glucose (5.6,11.1,16.7 and 27.6 mmol/L),then treat with 10 μg/mL Benzyl propionate nandrolone for 48 h. Nampt and FOXO1 protein expression was detected by Western blot assay. Cell cycle was determined by FCM and cell insulin secreted level was measured with radioimmuno-assay.ResultsTreated with benzyl propionate nandrolone for 48 h,1) G0/G1phase retardation effect of the cell cycle was relieved(Plt;0.01)when the cell cultured in lower energy, but 2) G2/M block effect of the cell significantly remitted(Plt;0.01) under the condition of high glucose concentration. 3) Benzyl propionate nandrolone can promote Nampt protein expression(Plt;0.05) and promoted insulin secretion, inhibiting the dephosphorylated FOXO1 expression(Plt;0.01).ConclusionBenzyl propionate nandrolone would promote islet NIT-1 cell proliferation and insulin se-cretion. These effects are closely related to the inhibition of FOXO1 inhibit of FOXO1 through Nampt increase.

pancreatic islet cell; benzyl propionate nandrolone; Nampt; FOXO1; cell cycle

2013-10-08

2013-11-15

國家自然科學(xué)基金(30860116, 31060161)；廣西科技廳科研基金(桂科自0728230)；廣西教育廳2013年自治區(qū)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃立項(xiàng)項(xiàng)目〔桂教高教(2013)14號〕；廣西教育廳科研資助課題〔桂教科研(2010)10號, 201010LX325，201010LX326〕

*通信作者(correspondingauthor): lpfeng1226@sina.com

1001-6325(2014)01-0068-04

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