兩種非病毒載體介導(dǎo)microRNA轉(zhuǎn)染的對比

高 聰，黃 莉，梁 兵，袁 芳，龍友明，鄭揚(yáng)波，陳夢宇

(廣州醫(yī)科大學(xué) 1.神經(jīng)科學(xué)研究所； 2.附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510260)

兩種非病毒載體介導(dǎo)microRNA轉(zhuǎn)染的對比

高 聰1，2*，黃 莉1，梁 兵2，袁 芳2，龍友明1，鄭揚(yáng)波1，陳夢宇1

(廣州醫(yī)科大學(xué) 1.神經(jīng)科學(xué)研究所； 2.附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510260)

microRNA作為核酸類藥物，在細(xì)胞和生物體內(nèi)存在穩(wěn)定性差，半衰期短，轉(zhuǎn)染效率低，靶向性差[1]，故轉(zhuǎn)染過程需要高效、高安全性的載體。Lipofectamine是常用的轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體，可與DNA形成復(fù)合物，有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)染能力。聚乙烯亞胺 (polyethyleneimine, PEI) 屬陽離子聚合物，在體內(nèi)外均有較高的轉(zhuǎn)染效率，不良反應(yīng)較低[2]。選擇適合的小分子RNA基因載體對其后續(xù)研究至關(guān)重要。本研究分別選擇了脂質(zhì)體lipofectamin2000和陽離子聚合物PEI作為microRNA的轉(zhuǎn)染載體，在體外檢測其在懸浮細(xì)胞THP-1中的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞死亡率，比較兩種轉(zhuǎn)染載體的轉(zhuǎn)染特性及作為microRNA基因載體的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料：1)試劑PEI(Sigma公司，408727-100 mL)；has-miR-155 mimics、Hairpin-it miRNAs q-PCR Quantitation Kit(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑盒(invitrogen，lot no.569165)等。2)細(xì)胞系：人單核巨噬白血病細(xì)胞THP-1(ATCC)。

1.2 方法：1)PEI介導(dǎo)FAM標(biāo)記的microRNA(miR-155 mimics)轉(zhuǎn)染效率評估。2)熒光鏡下觀察microRNA轉(zhuǎn)染效果，取對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞以完全培養(yǎng)基在24孔板中培養(yǎng)。實驗分為 4組：①空白組：不加轉(zhuǎn)染試劑，不加miRNA；②空轉(zhuǎn)組：不加轉(zhuǎn)染試劑，只加miRNA；③Lipo組：用Lipofectamine 2000/miR-155復(fù)合物轉(zhuǎn)染；④PEI組：用PEI/miR-155復(fù)合物不同N/P比值(指的是PEI/microRNA復(fù)合物中 PEI分子所含的 N原子與microRNA分子中所含的P原子的摩爾比)轉(zhuǎn)染，比值分為60∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1和10∶1組，Lipo/miR-155復(fù)合物以2 μL/20 pmol配得，按說明書操作轉(zhuǎn)染，每組實驗重復(fù)3次。3)轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞死亡數(shù)，同上實驗分4組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24 h，分別以DAPI、PI染色，在熒光鏡下觀察。轉(zhuǎn)染后用流式細(xì)胞儀分別檢測轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞死亡數(shù)，篩選出轉(zhuǎn)染效率最優(yōu)體系。實驗重復(fù)3次結(jié)果取平均值。

1.3 has-miR-155 mimic的轉(zhuǎn)染在THP-1中的表達(dá)：用上述實驗篩選出轉(zhuǎn)染效率最優(yōu)體系PEI與microRNA的N/P=30，按此體系轉(zhuǎn)染。實驗分為 2組：① 空白組②PEI/microRNA組。轉(zhuǎn)染后抽提THP-1細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后作q-PCR檢測各組miR-155在細(xì)胞內(nèi)的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 PEI介導(dǎo)FAM標(biāo)記的microRNA轉(zhuǎn)染效率評估：1)熒光鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，可見lipo組與PEI組轉(zhuǎn)染后，均有帶熒光的細(xì)胞；隨著PEI與microRNA的N/P比值逐漸下降，帶有熒光的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。兩組細(xì)胞中熒光主要分布在胞質(zhì)中，也有分布于胞核內(nèi)；PI染色后，lipo組轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡數(shù)比PEI組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞死亡數(shù)多(圖1)。

2)流式細(xì)胞儀檢測不同組別轉(zhuǎn)染效率和死亡率：轉(zhuǎn)染率中l(wèi)ipo組和PEI各組轉(zhuǎn)染效率明顯高于空白組和空轉(zhuǎn)組；PEI組N/P為30∶1、50∶1、60∶1組轉(zhuǎn)染效率均明顯高于lipo組； PEI組N/P為10∶1、20∶1死亡率明顯低于lipo組；PEI組N/P為50∶1、60∶1死亡率明顯高于lipo組。根據(jù)以上結(jié)果，篩選出PEI組的N/P值30∶1為最優(yōu)轉(zhuǎn)染體系(圖2)。

2.2 miR-155 mimic的轉(zhuǎn)染在THP-1中的表達(dá)：轉(zhuǎn)染miR-155 mimics后THP-1細(xì)胞內(nèi)miR-155的相對表達(dá)量，以PEI/microRNA N/P=30轉(zhuǎn)染后miR-155在細(xì)胞內(nèi)的相對表達(dá)量(1.32±0.70)明顯高于空白組(4.37±0.75)，可認(rèn)為PEI/microRNA組能有效轉(zhuǎn)染microRNA，介導(dǎo)miR-155在細(xì)胞內(nèi)的過表達(dá)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)RNA干擾可成為體內(nèi)實驗的強(qiáng)有力工具，并有望成為一種有效的疾病治療手段?；蛑委熽P(guān)鍵步驟之一就是將基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過程需要高效、高安全性的載體。本實驗通過熒光顯微鏡觀察兩種載體轉(zhuǎn)染miRNA分子均能夠進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而進(jìn)入RNAi 作用通路。影響轉(zhuǎn)染效率的因素包括：細(xì)胞種類、細(xì)胞本身狀態(tài)、載體結(jié)構(gòu)、載體與基因混合比例等[3]。 Fischer等對聚合物進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性實驗，發(fā)現(xiàn)陽離子聚合物的毒性與陽離子聚合物的分子質(zhì)量、電荷密度、空間構(gòu)型以及陽離子聚合物與核酸結(jié)合的復(fù)合物的表面電位等因素有關(guān)[4]。已知PEI的轉(zhuǎn)染效率與N/P相關(guān)。為優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果，有必要篩選出最優(yōu)轉(zhuǎn)染體系。本實驗PEI組N/P=20和30時，轉(zhuǎn)染率較高，死亡率較小，可選擇作為基因轉(zhuǎn)染體系。PEI轉(zhuǎn)染miR-155后，miR-155在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量顯著增高，可見轉(zhuǎn)染后miR-155在胞內(nèi)有一定穩(wěn)定性。

A.blank control；B.Lipo/miR-155；C.PEI/miR-155；1.in light microscope；2.green fluorescence in microscope；3.dyed with DAPI；4.dyed with PI

圖1轉(zhuǎn)染miR-155mimics-FAM的THP-1細(xì)胞經(jīng)DAPI和PI染色后熒光顯微鏡圖
Fig1THP-1cellstransfectedmiR-155mimics-FAMbydifferentdeliveryvectors,weredyedwithDAPIandPI(×400)

CON.blank control；NC.negative control；Lipo.lipo2000/miR-155；PEI 10～60.PEI/miR-155 N/P 10∶1～60∶1；*Plt;0.05 compared with lipo2000/miR-155圖2 流式細(xì)胞儀檢測不同載體組別轉(zhuǎn)染的效率和死亡率Fig 2 Flow cytometry detects transfection efficiency and PI stain of different groups(±s,n=9)

綜上所述，PEI在介導(dǎo)miRNA轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞的效率可優(yōu)于lipofectamin2000。PEI可作為一種良好的基因載體用于體外轉(zhuǎn)染miRNA，這為進(jìn)一步研究PEI介導(dǎo)的miRNA分子體內(nèi)基因沉默效應(yīng)的機(jī)制和體內(nèi)外基因治療提供了依據(jù)。

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2013-07-18

2013-12-19

國家自然基金青年項目(81100890)；廣東省自然科學(xué)基金(S2013010016262)；廣東省科技項目(2012B031800240,2012B061700042)；廣州市屬高校羊城學(xué)者科研項目(10A010G)

*通信作者(correspondingauthor)： smilegaocong@126.com

1001-6325(2014)04-0544-02

R 962

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