MEF來源的間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)生成的調(diào)節(jié)型樹突狀細胞的基因表達譜分析

葛超卓，劉星霞，任少達，趙春華

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 組織工程中心， 北京 100005)

主編點評：

樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是高度異質(zhì)性的細胞群體，根據(jù)DC的功能特點，具有很強調(diào)節(jié)功能的DC亞群被命名為調(diào)節(jié)性DC(regulatory DC)。葛超卓等人研究MEF-MSC誘導(dǎo)HPCs生成的調(diào)節(jié)性DC與不成熟DC(imDC)和成熟DC(maDC)的基因表達譜，揭示了三者在功能相關(guān)基因、免疫相關(guān)基因和信號通路相關(guān)基因方面的顯著差異，進一步豐富了界定DC亞群的依據(jù)。

研究論文

MEF來源的間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)生成的調(diào)節(jié)型樹突狀細胞的基因表達譜分析

葛超卓，劉星霞，任少達，趙春華*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 組織工程中心， 北京 100005)

目的研究MEF來源的間充質(zhì)干細胞(MEF-MSC)誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)型樹突狀細胞(MEF-regDC)與不成熟樹突狀細胞(imDC)和成熟樹突狀細胞(maDC)之間的基因表達譜差異，從而揭示前者的基因表達特點。方法將骨髓造血干細胞與MEF-MSC共培養(yǎng)制備MEF-regDC，用Agilent芯片對3種樹突狀細胞(DC)進行基因芯片檢測及相關(guān)分析，分析項目包括：差異倍數(shù)計算、主成分分析(PCA)和Go分類。結(jié)果MEF-regDC具有特征性的形態(tài)、表型和基因表達譜，PCA分析表明，MEF-regDC、imDC和maDC是不同的DC亞群，MEF-regDC與imDC相比，表達差異在2倍以上的基因數(shù)共有13 369個，差異在6倍以上的有3 247個，MEF-regDC與maDC相比，表達差異在2倍以上的基因數(shù)共有11 326個，差異在5倍以上的有3 299個，進一步的分析顯示，3者在功能調(diào)節(jié)相關(guān)基因，免疫相關(guān)的基因和信號通路相關(guān)的基因的表達也有顯著差異。結(jié)論MEF-MSCs誘導(dǎo)HPCs生成的MEF-regDC是一不同于傳統(tǒng)imDC及maDC的具有特征性基因表達譜的DC亞群。

樹突狀細胞；間充質(zhì)干細胞；基因差異；基因芯片分析

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為一類重要的干細胞，它不僅具有自我更新和多向分化潛能，而且更為重要的是具有較低的免疫原性及較強的免疫調(diào)節(jié)性[1-3]。研究表明，MSCs能夠分泌抑制性細胞因子，抑制T淋巴細胞的活化、增殖，以及樹突細胞(dendritic cells，DCs)的成熟和功能[4-8]。MSCs能夠在體內(nèi)外作用于T、B淋巴細胞而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[9]，但是關(guān)于MSCs和重要的抗原遞呈細胞之一的樹突細胞的相互關(guān)系的研究不多，且MSCs對樹突細胞的免疫調(diào)控作用機制尚不明確。有研究表明，MSCs無論對造血干細胞還是成熟樹突狀細胞(mature dendritic cells，maDCs)都具有很重要的免疫調(diào)節(jié)作用，MSCs不僅能夠影響maDC的分化[10]，還能夠影響造血干細胞向DC(immature DC，imDC)的發(fā)育[11]。在此基礎(chǔ)上，本實驗著重研究MSCs誘生的regDC的基因表達譜特點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

基因芯片：mouse 4x44K microarrays(Agilent 公司)，其余分析所用試劑如下：

reagentcompanymodelnumbercy3NHSesterGEhealthcarePA13105aaUTPAmbionAM8436lowRNAinputlinearamplicationkitAgilent5184-3523geneexpressionhybridizationkitAgilent5188-5242geneexpressionwashbufferkit(includingwashbuffer1amp;2)Agilent5188-5327stabilizationanddryingsolutionAgilent5185-5979gasketslideAgilentG2534-60003hybridizationchamberAgilentG2534ARNeasyminikitQIAGEN74106

1.2 MEF-MSC的制備

常規(guī)法制備MEF-MSC[11]，用MSC培養(yǎng)液重懸細胞，接種在75 cm2的培養(yǎng)瓶中， 37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。

1.3 imDC和maDC的制備

常規(guī)法制備骨髓單個核細胞[11]，用含10 ng/mL mGM-CSF、5 ng/mL mIL-4和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，細胞以1×106/孔加入6孔板中，置37 ℃和5% CO2孵箱培養(yǎng)；24 h后，去懸浮細胞，重新加入含粒細胞-巨噬細胞集落刺激(GM-CSF)和白細胞介素-4(IL-4)新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；3 d后，輕輕去除懸浮細胞，收集疏松貼壁細胞，用免疫磁珠純化CD11c+細胞，獲得富集的imDCs；純化的imDCs繼續(xù)在含10 ng/mL LPS的培養(yǎng)基中孵育24～48 h，即獲得maDCs。

1.4 MEF-regDC的制備

將純化的骨髓造血干細胞與MEF-MSC共培養(yǎng)5～7 d，獲得MEF-regDCs[11]。

1.5 基因芯片的制備

基因芯片的制備方法，簡述如下：1)總RNA的純化(QIAGEN RNeasy? Mini Kit)。2)cDNA第一鏈和第二鏈一步法合成。3)aaUTP標記cRNA合成。4)cRNA純化(QIAGEN RNeasy? Mini Kit)。5)cRNA濃度測定。6)cRNA樣品熒光標記。7)熒光標記cRNA樣品純化(QIAGEN RNeasy? Mini Kit)，QIAGEN RNeasy Mini kit純化cRNA，具體方法可參見QIAGEN公司隨試劑盒提供的操作手冊。8) 熒光分子濃度及摻入率計算，Cy3-濃度(μmol/L)=A552/0.15；Cy3-摻入率(μmol/g)= Cy3-濃度/cRNA濃度(g/L)。9)cRNA樣品片段化和芯片雜交(4×44K microarrays)。10)芯片洗滌，取出芯片于洗液1中洗滌1 min，再將芯片放入洗液2中洗滌1 min(37 ℃)。11)芯片掃描，Agilent掃描儀中掃描，分辨率為5 μm，掃描儀自動以100%和10%光電倍增管(PMT)各掃描一次，兩次結(jié)果Agilent軟件可自動合并。12)數(shù)據(jù)由上海伯豪公司的在線數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)SAS(SBC Analysis System)分析。分析項目包括：差異倍數(shù)計算(Fold change)、主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)和Go分類(GoTerm to Gene)。①差異倍數(shù)計算：是直接對兩組數(shù)據(jù)均一化以后的信號值計算其差異的倍數(shù)。②主成分分析：其原理是找到數(shù)據(jù)方差最大的2個或者3個主成分(就是向量)，將數(shù)據(jù)投影在這些主成分上，已達到降維的目的，分析結(jié)果以二維圖像顯示，通過圖像上的點之間的相互距離來顯示樣品之間的相似度。③Go分類：每個GoTerm對應(yīng)基因的情況以及探針對應(yīng)基因在Go數(shù)據(jù)庫中分組顯示。

2 結(jié)果

2.1 MEF-MSC的形態(tài)

細胞生長呈現(xiàn)為梭形或紡錘形，類似成纖維樣形態(tài)(圖1)。

圖1 MEF-MSC細胞形態(tài)Fig 1 The morphology of MEF-MSC(×100)

2.2 MEF-MSC誘導(dǎo)生成的regDC的形態(tài)

鏡下觀察可見，MEF-regDC的形態(tài)和imDC相似，但與maDC相比，MEF-regDC的樹突較少且短(圖2)。

2.3 基因表達譜分析

2.3.1 主成分分析：PCA分析結(jié)果表明，MEF-regDC是與imDC和maDC不同的亞群(圖3)。

2.3.2 差異倍數(shù)計算：芯片結(jié)果顯示，MEF-regDC的基因表達譜與imDC和maDC的不同，3者之間存在表達差異的基因數(shù)量也有差別(表1)。

表1 MEF-regDC與imDC、maDC間的差異基因數(shù)量Table 1 The number of different genes between MEF-regDC and imDC amp; maDC

A.MEF-regDC; B.imDC; C.maDC圖2 MEF-regDC、imDC和maDC的形態(tài)Fig 2 The morphology of MEF-regDC, imDC and maDC(×200)

圖3 MEF-regDC, imDC與maDC的PCA分析Fig 3 PCA of MEF-regDC, imDC and maDC

2.3.3 基因表達譜分類分析：在存在差異的基因當中，應(yīng)用Go分類進一步分析分別得到MEF-regDC與imDC間關(guān)于功能調(diào)節(jié)的差異基因數(shù)量(圖4)，與免疫相關(guān)的差異基因數(shù)量(圖6)以及MEF-regDC與imDC間信號通路相關(guān)的差異基因數(shù)量(圖8)。同樣，對MEF-regDC和maDC也進行了相似的分析(圖5，7，9)。

1)功能調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達差異：

2)與免疫相關(guān)的基因的表達差異：

3)信號通路相關(guān)的基因的表達差異：

圖4 MEF-regDC與imDC間關(guān)于功能調(diào)節(jié)的差異基因數(shù)量Fig 4 The number of different genes related to function regulation between MEF-regDC and imDC

圖5 MEF-regDC與maDC間關(guān)于功能調(diào)節(jié)的差異基因數(shù)量Fig 5 The number of different genes related to function regulation between MEF-regDC and maDC

圖6 MEF-regDC與imDC間與免疫相關(guān)的差異基因數(shù)量Fig 6 The number of different genes related to immune function between MEF-regDC and imDC

圖7 MEF-regDC與maDC間與免疫相關(guān)的差異基因數(shù)量Fig 7 The number of different genes related to immune function between MEF-regDC and maDC

圖8 MEF-regDC與imDC間與信號通路相關(guān)的差異基因數(shù)量Fig 8 The number of different genes related to signal passways between MEF-regDC and imDC

圖9 MEF-regDC與imDC間與信號通路相關(guān)的差異基因數(shù)量Fig 9 The number of different genes related to signal passways between MEF-regDC and maDC

3 討論

作為一類重要的干細胞，MSC不僅具有自我更新和多向分化潛能，而且具有及較強的免疫調(diào)節(jié)作用和較低的免疫原性，因而，在器官移植或者自身免疫性疾病的治療中發(fā)揮重要作用。MEF來源的MSC可以誘導(dǎo)骨髓造血干細胞生成具有免疫調(diào)節(jié)作用的樹突狀細胞(MEF-regDC)[11]，進一步的分析顯示，MEF-regDC具有特征性的形態(tài)、表型和基因表達特點。

對3種DC細胞進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，結(jié)果較直觀地反映了3者間的差異程度。MEF-regDCs與imDC的差異程度較MEF-regDCs和maDC間的差異小。

應(yīng)用Go分類分析可知，MEF-regDC與imDC的差異基因中，1 773個基因與分子結(jié)構(gòu)相關(guān)，1 868個基因與細胞組分相關(guān)，1 680個基因參與了生物學(xué)功能(其中760個基因參與了功能調(diào)控)。在生物學(xué)功能相關(guān)差異基因中挑選與免疫相關(guān)的基因進行深入分析，免疫系統(tǒng)調(diào)控相關(guān)基因69個，占目前已知總數(shù)的23.08%(69/299)，差異較大。此外，兩細胞群體間的信號通路也存在一定的差異。由上可見，MEF-regDCs與imDCs在免疫學(xué)功能基因表達等多方面存在差異。

同樣，應(yīng)用Go分類分析可知，MEF-regDC與maDC的差異基因中，1 777個基因與分子結(jié)構(gòu)相關(guān)，1 845個基因與細胞組分相關(guān)，1 663個基因參與了生物學(xué)功能(其中783個基因參與了功能調(diào)控)。與免疫相關(guān)的差異基因中，免疫系統(tǒng)調(diào)控相關(guān)基因81個，占目前已知總數(shù)的27.09%(81/299)，各項差異值均高于MEF-regDC與imDC間的差異。而且，兩細胞群體間的信號通路差異也較大。由上可見，MEF-regDCs與maDCs存在較大的差異。

總之，MEF-MSCs誘導(dǎo)HPCs生成的MEF-regDCs是一不同于傳統(tǒng)imDC及maDC的具有特征性基因表達譜的DC亞群。

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The gene expression profile analysis of regDC induced by MEF-MSC

GE Chao-zhuo, LIU Xing-xia, REN Shao-da, ZHAO Chun-hua*

(Center of Tissue Engineering, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo investigate the difference of gene expression between MEF-regDC and imDC amp; maDC, in order to demonstrate the character of MEF-regDC.MethodsWe first harvested MEF-regDC by co-culture of bone marrow hematopoietic stem cell with MSC, then analysed 3 types of DCs, including fold change, principal component analysis and Go Term to gene.ResultsMEF-regDC had the characteristic of morphology, phenotypes and gene expression profile, the PCA illustrated that MEF-regDC and imDC amp; maDC were 3 different type of DC, and there were 13 369 genes that were 2 folds different between MEF-regDC and imDC, and the number of genes that were 6 fold different between the 2 types of DCs is 3247; meanwhile, the number of different genes between MEF-regDC and maDC are 11326 and 3299, respectively. Further analysis demonstrated that, there were obvious difference of function regulate genes, immune-related genes and signaling pathways related genes among these three type of DCs.ConclusionsMEF-regDC is a new type of DC which is different from imDC and maDC, and has specific gene expression profiles.

dendritic cells; mesenchymal stem cells; gene differentiation; gene analysis

2013-12-20

2014-01-11

國家自然科學(xué)基金(30911130363)

*通信作者(correspondingauthor)： zhaoch16@hotmail.com

1001-6325(2014)04-0433-06

R 329.2

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