脂聯(lián)素減輕高糖誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞系損傷

李 熠，匡雙玉，尹 凱，匡穩(wěn)定，桂慶軍*

(南華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 1.診斷學(xué)教研室；2.附屬第二醫(yī)院， 湖南 衡陽(yáng) 421001)

研究論文

脂聯(lián)素減輕高糖誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞系損傷

李 熠1，匡雙玉2，尹 凱1，匡穩(wěn)定2，桂慶軍1*

(南華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 1.診斷學(xué)教研室；2.附屬第二醫(yī)院， 湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的觀察脂聯(lián)素(APN)對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞系損傷的保護(hù)作用及NF-κB與LOX- 1蛋白表達(dá)在其中的作用。方法30 mmol/LD-葡萄糖作用于HUVEC- 12(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系)，不同濃度的脂聯(lián)素(10、20和40 μg/mL)作用48 h及20 μg/mL 脂聯(lián)素作用不同時(shí)間(12、24、48和72 h)后，倒置相差顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，Western blot檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和LOX- 1蛋白表達(dá), 間接免疫熒光法檢測(cè)NF-κB核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果脂聯(lián)素作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改善，折光性增強(qiáng)，胞內(nèi)顆粒物減少，細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)整；同時(shí)，LOX- 1蛋白表達(dá)下調(diào)(Plt;0.05)，NF-κB活性降低(Plt;0.05)，并呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性(n=3,Plt;0.05)。結(jié)論脂聯(lián)素可能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路引起LOX- 1蛋白表達(dá)下調(diào)，從而發(fā)揮其對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

D-葡萄糖；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；脂聯(lián)素；LOX- 1；NF-κB

脂聯(lián)素(Adiponectin，APN)是一種由脂肪細(xì)胞分泌的血漿蛋白，通過(guò)抑制炎性反應(yīng)、保護(hù)血管內(nèi)皮、抗動(dòng)脈粥樣硬化及抑制血管新生等[1- 5]發(fā)揮其心血管保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)在高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞系損傷的模型上，觀察APN對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及NF-κB、LOX- 1蛋白表達(dá)在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

脂聯(lián)素(Ramp;D公司)；RMPI- 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶(Hyelone公司)；新生胎牛血清(杭州四季清公司)；BCA 蛋白定量試劑盒和Western印跡熒光檢測(cè)試劑盒(Hyclone. Pierce公司)；LOX- 1和NF-κB一抗(Santa Cruz公司)；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC-12)的培養(yǎng)

HUVEC- 12(ATCC公司)。HUVEC- 12培養(yǎng)在10%(體積分?jǐn)?shù))加熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中加青霉素和鏈霉素各1.0×105IU/L，培養(yǎng)條件為5%(體積分?jǐn)?shù))CO2，37 ℃，飽和濕度，0.125%的胰蛋白酶?jìng)鞔?待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%匯合的時(shí)候進(jìn)行試驗(yàn)。倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞為鵝卵石樣。

1.3 HUVEC- 12的形態(tài)學(xué)觀察

使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況。

1.4Westernblot檢測(cè)HUVEC-12中NF-κB和LOX-1蛋白質(zhì)的表達(dá)水平

收集不同條件處理的HUVEC- 12細(xì)胞，三去污裂解液裂解細(xì)胞，5 000 r/min離心去除沉淀，BCA試劑測(cè)定蛋白含量，上樣緩沖液調(diào)各組蛋白濃度使各組一致，經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳2 h(積層膠80 V，分離膠120 V)后電轉(zhuǎn)移(4 ℃，100 mA，3 h)至PDVF膜上，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果，并確定蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的位置。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，按1∶1 000加入兔抗鼠SREBP- 1一抗，37 ℃孵育2 h，TBST洗3次，1∶2 000加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗，37 ℃孵育0.5 h，TBST洗3次后，用Western blot熒光檢測(cè)試劑盒顯影、定影。結(jié)果重復(fù)3次。用圖象分析儀分析目的蛋白/內(nèi)參照吸光度比值。

1.5間接免疫熒光檢測(cè)HUVEC-12細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以4×104/孔接種于24孔培養(yǎng)板，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，按分組要求給以不同處理因素。處理終結(jié)，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，每孔加固定液(甲醇∶冰乙酸 3∶1)200 μL，在4 ℃條件下固定15 min，再用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加穿透液(0.25%聚乙二醇辛基苯基醚+5%二甲基亞砜混合液)1 mL，37 ℃放置45 min，再用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入一抗(1∶200)200 μL，37 ℃孵育1 h，預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入羅丹明和綠色熒光(FITC)標(biāo)記的二抗(1∶10)50 μL，37 ℃孵育1 h，熒光倒置顯微鏡下觀察并照相。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 D-葡萄糖誘導(dǎo)HUVEC- 12的形態(tài)學(xué)變化

不同濃度的D-葡萄糖(15、30和60 mmol/L)作用于HUVEC- 12 48 h及30 mmol/L D-葡萄糖作用于HUVEC- 12不同時(shí)間(12、24、48及72 h)后，對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞之間緊密連接，呈多角形或扁平形，折光性強(qiáng)，而不同劑量和不同作用時(shí)間的高糖誘導(dǎo)組的HUVEC- 12折光性變?nèi)酰帕休^為紊亂，細(xì)胞系模糊，細(xì)胞間隙明顯增大，細(xì)胞內(nèi)顆粒狀物增多。以30 mmol/LD-葡萄糖作用于HUVEC- 12 48 h的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化最明顯(圖1)。

2.2APN干預(yù)下的D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

不同濃度APN(10、20和40 μg/mL)作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12 48 h及20 μg/mL APN作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12不同時(shí)間(12、24、48 和72 h)后，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組內(nèi)皮細(xì)胞收縮，變圓，胞體變小，胞內(nèi)顆粒明顯增多，而APN干預(yù)組相比誘導(dǎo)組其內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改善較明顯，折光性增強(qiáng)，胞內(nèi)顆粒減少。排列相對(duì)規(guī)整。以20 μg/mL APN作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12 48 h形態(tài)變化最顯著(圖2)。

A.control; B.model圖1 D-葡萄糖誘導(dǎo)HUVEC- 12細(xì)胞形態(tài)改變Fig 1 The morphology changes of HUVEC- 12 cells induced by D-glucose(×400)

A.control; B.model; C.APN圖2 APN干預(yù)下的D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12形態(tài)改變Fig 2 The morphology changes of D-glucose induced HUVEC- 12 by APN(×400)

2.3APN對(duì)D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-12中NF-κB及LOX-1蛋白表達(dá)的影響

不同濃度APN(10、20及40 μg/mL)作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12 48 h后，NF-κB及LOX- 1蛋白表達(dá)下調(diào)，其中20 μg/mL APN使NF-κB及LOX- 1蛋白表達(dá)下調(diào)最明顯 (圖3)。

2.4APN干預(yù)下D-葡萄糖誘導(dǎo)HUVEC-12中NF-κB及LOX-1蛋白表達(dá)的時(shí)效變化

20 μg/mL APN作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12不同時(shí)間(12、24、48和72 h)后，在APN不同時(shí)間的干預(yù)下，D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12中NF-κB及LOX- 1蛋白表達(dá)均下調(diào)，其中作用48 h后的內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB及LOX- 1蛋白表達(dá)下調(diào)最明顯(圖4)。

2.5APN對(duì)D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-12中NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響

20 μg/mL脂聯(lián)素作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12 48 h后，正常對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞組中， P65綠色熒光信號(hào)信號(hào)主要定位于胞質(zhì)，胞核少見(jiàn)或未見(jiàn)(圖5)。

1.model；2.10 μg/mL；3.20 μg/mL；4.40 μg/mL; *Plt;0.05 compared with model group圖3 APN干預(yù)下D-葡萄糖誘導(dǎo)HUVEC- 12細(xì)胞中LOX- 1蛋白表達(dá)量效關(guān)系Fig 3 LOX- 1 protein expression with a dose-dependant manner in D-glucose induced HUVEC- 12 by APN(n=3)

1.model; 2.12 hours; 3.24 hours; 4.48 hours; 5.72 hours; *Plt;0.05 compared with model group圖4 APN干預(yù)下D-葡萄糖誘導(dǎo)HUVEC- 12中LOX- 1蛋白表達(dá)時(shí)效關(guān)系Fig 4 LOX- 1 protein expression with a time-dependant manner in D-glucose induced HUVEC- 12 by APN(n=3)

A.control; B.model; C.APN圖5 不同作用下的HUVEC- 12中 NF-кB-P65蛋白的核轉(zhuǎn)位熒光圖Fig 5 Different fluorescent nuclear translocation of NF-кB-P65 in HUVEC-12 cells(×400)

3 討論

APN是由脂肪細(xì)胞特異性分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽或蛋白質(zhì), 目前認(rèn)為其是一種胰島素抵抗和動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)因子[6- 7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度脂聯(lián)素作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12不同時(shí)間，觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LOX- 1表達(dá)。發(fā)現(xiàn)隨APN濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HUVEC- 12中LOX- 1蛋白表達(dá)均下調(diào)，受損細(xì)胞形態(tài)得到了一定程度的改善；證實(shí)了APN可以通過(guò)下調(diào)高糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12中LOX- 1的表達(dá)，從而發(fā)揮其保護(hù)血管內(nèi)皮的功能。

文獻(xiàn)報(bào)道，LOX- 1在介導(dǎo)內(nèi)皮損傷中發(fā)揮重要作用[8]。調(diào)控LOX- 1蛋白表達(dá)的機(jī)制眾多，炎性因子，氧化應(yīng)激產(chǎn)物以及機(jī)械刺激等可誘導(dǎo)其表達(dá)。大鼠LOX- 1基因啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)順式作用元件，如NF-κB，表明LOX- 1的表達(dá)可能受NF-κB激活的調(diào)控[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度的APN作用高糖誘導(dǎo)組內(nèi)HUVEC- 12不同時(shí)間，在受損的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB-P65表達(dá)下調(diào)的同時(shí)，其對(duì)應(yīng)的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)LOX- 1表達(dá)水平也下調(diào)，表明LOX- 1蛋白的表達(dá)下調(diào)與APN作用于受損內(nèi)皮細(xì)胞引起的NF-κB蛋白表達(dá)水平下調(diào)存在一定關(guān)系。

為了進(jìn)一步說(shuō)明APN可以通過(guò)NF-κB途徑調(diào)控LOX- 1表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)用免疫熒光觀察使用了APN后，APN可抑制受損內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的NF-κB向胞核內(nèi)遷移，阻礙其啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，減少LOX- 1蛋白的表達(dá)。其機(jī)制可能與APN與細(xì)胞系內(nèi)特定的靶基因結(jié)合，啟動(dòng)了IκB等抑制亞單位的表達(dá)或者抑制了IκB的快速磷酸化和降解，減少了NF-κB活化[10]。

本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的HUVEC- 12為研究對(duì)象，觀察了APN對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，同時(shí)研究了在此過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)NF-κB與LOX- 1蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步闡明糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化早期的發(fā)病機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Motoshima H,Wu X,Mahadev K,etal.Adiponectin suppresses proliferation and superoxide generation and enhances eNOS activity in endothelial cells treated with oxidized LDL[J].Bioch em Biophys Res Commun,2004,315:26- 71.

[2] Zhu W,Cheng KK,Vanhoutte PM,etal.Vascular effects of adiponectin: molecular mechanisms and potential therapeutic intervention[J].Clin Sci (Lond),2008, 114:361- 374.

[3] Kizer JR, Barzilay JI, Kuller LH,etal.Adiponectin and risk of coronary heart disease in older men and women[J].J Clin Endocrinol Metab,2008,93: 3357- 3364.

[4] Cai XJ，Chen L，Li L，etal.Adiponectin inhibits lipopoly saccharide-induced adventitial fibroblast migration and transition to myofibroblasts via AdipoR1-AMPK-NOS pathway[J].Mol Endocrinol，2010，24:218- 228.

[5] Lovren F，Pan Y，Quan A，etal. Adiponectin primes human monocytes into alternative anti-inflammatory M2 macrophages[J].Am J Physiol Heart Cir Physiol，2010，299:H656-H653.

[6] Zhang H，Cui J，Zhang C. Emerging role of adipokines as mediators in atherosclerosis[J]. World J Cardiol，2010，2:370- 376.

[7] Eren P, Camus S, Matrone G,etal. Adiponectinemia controls proangiogenic cell therapy[J]. Stem Cells, 2009, 27: 2712- 2721.

[8] Ogura S,Kakino A,Sato Y,etal.LOX- 1: the multifunctional receptor underlying cardiovascular dysfunction[J].Circ J，2009，73: 1993- 1999.

[9] Zhu W,Cheng KK,Vanhoutte PM,etal.Vascular effects of adiponectin: molecular mechanisms and potential therapeutic intervention[J].Clin Sci (Lond),2008, 114:361- 374.

[10] Ekmekei H.Ekmekei OB.The role of adiponectin in althemsclerosis and thrombosis[J].Clin Apple Thromb Hemoat,2006,12:163- 168.

Adiponectin alleviates hyperglycemia induced vascular endothelial cells injury

LI Yi1, KUANG Shuang-yu2, YIN Kai1, KUANG Wen-ding2, GUI Qing-jun1*

(1.Medical College, University of South China; 2.the Second Affiliated Hospital,University of South China， Hengyang 421001， China)

ObjectiveTo observe the protective effect of adiponectin (APN) on hyperglycemia-induced vascular endothelial cell injury,and to investigate the expresstion of NF-κB and LOX- 1 in the role of the protection process.MethodsD-Glucose of 30 mmol/L effect on HUVEC- 12 for 48 hours to create a hyperglicemia-model of injured vascular endothelial cells, Incubate the cells with different concentration adiponectin(10,20,40 μg/mL) for 48 hours and adiponectin of 20 μg/mL for different time(12,24,48,72 h)and then to observe the morphologic changes of the endothelial cells and the expression of NF-κB and LOX- 1 protein in the HUVEC- 12 was detected by Western blot, and NF-κB nuclear translocation in cells was observed by indirect immunofluorescence.ResultsD-Glucose-induced HUVEC- 12 were effected by adiponectin with different density and time, The morphologic changes of the cells converted to ameliorate: the reflected light of the HUVEC- 12 was strengthened, particulate matter in cells was not clear and the cell shape converted from roundness to flat or polygon, NF-κB and LOX- 1 protein expression were down-regulated partly with a dose and time-dependence(n=3,Plt;0.05).ConclusionsAdiponectin (APN) may down-regulate LOX- 1 protein expression through NF-kB signaling pathway so the protective effect on D-Glucose-induced HUVEC- 12.

D-Glucose; HUVEC- 12; Adiponectin; LOX- 1; NF-κB

2013- 03- 25

2014- 04- 18

2013年湖南省教育廳優(yōu)秀青年科研項(xiàng)目(2013B098)

*通信作者(correspondingauthor)：zd81412@163.com

1001-6325(2014)10-1386-05

R 9

A