多巴胺受體2減輕離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷

李鴻珠，高 君，郝曉敏，張麗敏，陳俊亭

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)系專(zhuān)業(yè)， 黑龍江 哈爾濱 150086； 2.哈爾濱市第一醫(yī)院 骨三科，黑龍江 哈爾濱 150010； 3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心， 黑龍江 哈爾濱 150086；4.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 附屬第四醫(yī)學(xué)院 麻醉科， 黑龍江 哈爾濱 150001)

研究論文

多巴胺受體2減輕離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷

李鴻珠1*，高 君2，郝曉敏3，張麗敏3，陳俊亭4

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)系專(zhuān)業(yè)， 黑龍江 哈爾濱 150086； 2.哈爾濱市第一醫(yī)院 骨三科，黑龍江 哈爾濱 150010； 3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心， 黑龍江 哈爾濱 150086；4.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 附屬第四醫(yī)學(xué)院 麻醉科， 黑龍江 哈爾濱 150001)

目的觀察多巴胺受體2(DR2)對(duì)離體大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)損傷的影響及其可能機(jī)制。方法將大鼠40只，每組n=10，隨機(jī)分成對(duì)照組(control)、I/R組、10 μmol/L Bromocriptine(DR2激動(dòng)劑)組(Bro)，10 μmol/L Haloperidol (DR2抑制劑)組(Hal)。用Langendorff離體灌流裝置，復(fù)制大鼠心肌I/R損傷模型。Powerlab生理記錄儀記錄心功能；比色法測(cè)定冠脈流出液LDH、CK活性和心肌組織勻漿SOD活性以及MDA含量；TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡；Western blot檢測(cè)DR2、Bcl- 2、caspase- 3和caspase- 9蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，I/R組DR2、Bcl- 2、caspase- 3和caspase- 9蛋白表達(dá)、LDH和CK活性、MDA含量和細(xì)胞凋亡率均增加(Plt;0.01)，唯有SOD活性降低，心功能減弱(Plt;0.01)。與I/R組比較，Bro降低LDH和CK活性、MDA含量、細(xì)胞凋亡率、caspase- 3和caspase- 9的表達(dá)，升高SOD活性，改善心功能和進(jìn)一步增加Bcl- 2的表達(dá)(Plt;0.01)；Hal對(duì)上述指標(biāo)影響不顯著。結(jié)論DR2可減輕心肌I/R損傷，其機(jī)制與抗氧化、清除自由基、上調(diào)Bcl- 2表達(dá)以及下調(diào)caspase- 3和caspase- 9的表達(dá)有關(guān)。

多巴胺受體2；缺血/再灌注損傷；細(xì)胞凋亡；大鼠；心肌

缺血性心臟病的死亡率占所有器官之首。揭示心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制和研發(fā)有效的保護(hù)藥物，已成為國(guó)內(nèi)外的關(guān)注熱點(diǎn)。

多巴胺受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，有5種亞型：D1、D2、D3、D4 和D5，根據(jù)其藥理作用和結(jié)構(gòu)特征將其分為D1和D2兩個(gè)家族，D1和D5受體屬于D1受體家族，D2、D3和D4受體屬于D2受體家族[1]。一直以來(lái)對(duì)多巴胺受體的研究，主要集中在帕杰森病、精神分裂癥、藥物成癮等神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病上[2- 3]。已有報(bào)道，從腦組織克隆出的所有DR在外周均存在[2- 3]。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌缺血/再灌注損傷過(guò)程中，DR2表達(dá)增加[3]，并且其激活通過(guò)抑制線粒體、死亡受體途徑及MAPK通路減輕乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷[4- 5]。但是，DR2激活對(duì)離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響及機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察DR2激活對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量0.25～0.3 kg，雌雄不拘，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供(合格證號(hào)：SCXK(黑)2013- 001)。

1.2 主要試劑

Bromocriptine(Bro)和Haloperidol(Hal)(Sigma-Aldrich公司)，Western 及IP細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)，DR2、Bcl- 2、caspase- 3和caspase- 9抗體(Santa Cruz Biotechnology 公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche試劑公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(2 mg/kg)及肝素(1 000 IU/kg體質(zhì)量)。麻醉后迅速取出心臟，通過(guò)主動(dòng)脈逆行插管連接在Langendorff離體灌流裝置上，以80 mmH2O的壓力Krebs-Henseleit磷酸緩沖液灌流大鼠心臟，灌流過(guò)程中用95% O2和5% CO2混合氣體平衡灌流液。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組：40只大鼠，隨機(jī)分為4組，每組n=10。1)對(duì)照組：心臟正常灌流180 min；2)I/R組：心臟先預(yù)灌注平衡20 min，停止灌流40 min之后再?gòu)?fù)灌120 min；3)Bro組：方法同I/R組，只是在復(fù)灌時(shí)加入10 μmol/L Bro；4)Hal組：方法同I/R組，只是在復(fù)灌時(shí)加入10 μmol/L Hal。

1.3.3 生化指標(biāo)檢測(cè)：心肌再灌注后，留取冠脈流出液，測(cè)定LDH和CK的活性。將心肌用組織勻漿器研磨并制成10%組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè) SOD 活性和 MDA 含量。

1.3.4 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取心室肌切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊，然后固定、脫水、浸蠟、包埋，制成厚度為10 μm的切片，光鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。正常心肌細(xì)胞核染成藍(lán)色，凋亡的細(xì)胞核呈棕褐色，數(shù)不少于500個(gè)心肌細(xì)胞核，凋亡率計(jì)算：AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/500)×100%

1.3.5 心功能測(cè)定：用Powerlab生理記錄系統(tǒng)記錄各項(xiàng)心功能指標(biāo)：左室末端舒張壓(left ventricular end diastolic pressure, LVEDP)，左室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure, LVDP)以及左室內(nèi)壓最大上升(下降)速率(positive and negative maximum rate of left ventricular pressure development,±dp/dtmax)。

1.3.6 Western blot檢測(cè)DR2、Bcl- 2、caspase- 3和caspase- 9蛋白表達(dá)：取心肌組織加入蛋白裂解液，冰浴40 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取50 μg蛋白樣品于10% SDS-PAGE凝膠電泳；隨后轉(zhuǎn)印于PVDF濾膜上，用5% 脫脂奶粉，37 ℃封閉1 h；用封閉液稀釋一抗，4 ℃振蕩過(guò)夜；TBST稀釋二抗，室溫振蕩孵育2 h；最后顯色，計(jì)算條帶吸光度值，蛋白表達(dá)水平以其與GAPDH吸光度比值來(lái)表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DR2蛋白表達(dá)變化

與對(duì)照組比較，I/R組DR2蛋白表達(dá)明顯增加(Plt;0.01)(圖1)。

*Plt;0.01 compared with control group圖1 DR2蛋白表達(dá)Fig 1 DR2 protein expressions

2.2 LDH、CK、SOD活性和MDA含量的變化

與對(duì)照組比較，I/R明顯增加LDH、CK活性和MDA含量，而降低SOD活性(Plt;0.01)；與I/R組比較，Bro顯著降低LDH、CK活性及MDA含量，升高SOD活性(Plt;0.01)(表1)。

表1 LDH、CK和SOD活性及MDA含量變化

*Plt;0.01 compared with control group;#Plt;0.01 compared with I/R group.

2.3 各組心功能變化

與對(duì)照組比較，I/R組心功能明顯減弱(Plt;0.01)；與I/R組比較，Bro顯著改善心功能(Plt;0.01)(表2)。

2.4 心肌細(xì)胞凋亡率的變化

與對(duì)照組比較，I/R組細(xì)胞凋亡率明顯增加(Plt;0.01)；與I/R組比較，Bro組細(xì)胞凋亡率明顯減少(Plt;0.01)(圖2)。

表2 心功能各個(gè)指標(biāo)的改變Table 2 The changes of cardiac fuction(±s, n=10)

*Plt;0.01 compared with control group;#Plt;0.01 compared with I/R group.

*Plt;0.01 compared with control group; #Plt;0.01 compared with I/R group圖2 心肌細(xì)胞凋亡率的變化Fig 2 The changes of the apoptosis rate ofcardiomyocytes(×400)

2.5 Caspase- 3、caspase- 9和Bcl- 2蛋白表達(dá)變化

與對(duì)照組相比，I/R增加caspase- 3、caspase- 9和Bcl- 2蛋白表達(dá) (Plt;0.01)；與I/R組比較，Bro降低caspase- 3和caspase- 9的表達(dá)，增加Bcl- 2的表達(dá) (Plt;0.01)(圖3)。

3 討論

目前認(rèn)為，心肌I/R損傷的機(jī)制與心肌能量代謝障礙、氧自由基大量產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌一系列內(nèi)皮因子等因素有關(guān)[6]。

*Plt;0.01 compared with control group; #Plt;0.01 compared with I/R group圖3 Caspase- 3、caspase- 9和Bcl- 2蛋白表達(dá)變化Fig 3 The changes of caspase- 3, caspase- 9 and Bcl- 2 protein expressions

氧自由基的大量產(chǎn)生，可使心肌組織脂質(zhì)過(guò)氧化物增多，MDA含量增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，使心肌細(xì)胞受損[3]。dp/dtmax、LVSP、LVEDP 等指標(biāo)，可反映心肌功能的情況[7]。本研究顯示，I/R增加DR2蛋白表達(dá)，且I/R組LDH和CK漏出及MDA含量均增加，SOD活性降低，心功能減弱；而B(niǎo)ro則減少LDH和CK漏出及MDA含量，升高SOD活性，改善心功能。說(shuō)明DR2激活可減輕心肌I/R損傷，其機(jī)制與清除自由基和減少脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。

心肌I/R損傷可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。I/R可引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開(kāi)放導(dǎo)致線粒體內(nèi)釋放細(xì)胞色素C(Cyt c)、Smac/DIABLO和AIF等線粒體凋亡因子，引起細(xì)胞凋亡[4]。Cyt c釋放到細(xì)胞質(zhì)后，可激活caspase- 9，后者進(jìn)一步激活 caspase- 3 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl- 2 通過(guò)抑制Cyt c的釋放和 caspase 激活發(fā)揮抗凋亡作用[4]。

本結(jié)果顯示，I/R組細(xì)胞凋亡率、caspase-3、caspase-9和Bcl- 2 蛋白表達(dá)均增加，而B(niǎo)ro降低細(xì)胞凋亡率，抑制 caspase- 3 和 caspase- 9 的表達(dá)，促進(jìn) Bcl- 2 的表達(dá)。說(shuō)明DR2 激活可通過(guò)下調(diào) caspase- 3 和 caspase- 9 的表達(dá)，上調(diào) Bcl- 2 的表達(dá)發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。I/R時(shí)Bcl- 2表達(dá)增加，可能是機(jī)體的一種代償性適應(yīng)性反應(yīng)。

綜上所述，DR2激活可減輕I/R對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，其機(jī)制與抗氧化、上調(diào)Bcl-2表達(dá)及下調(diào)caspase- 3/- 9的表達(dá)有關(guān)。激活心肌DR2有望為缺血性心臟病的防治提供一個(gè)新思路和新靶點(diǎn)。

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DR2 attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury of rats in vitro

LI Hong-zhu1*, GAO Jun2, HAO Xiao-min3, ZHANG Li-min3, CHEN Jun-ting4

(1.Dept. of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin 150086; 2.the First Hospital of Harbin, Harbin 150010; 3.Experiment Center, Harbin Medical University, Harbin 150086; 4.Dept. of Anesthesiology, the Fourth Affiliated Hospital ofHarbin Medical University, Harbin 150001, China)

ObjectiveTo observe the effects of dopamine receptors-2 (DR2) on the myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury in rats and to study the possible mechanisms.Methods40 Wistar rats were randomly divided into 4 groups (n=10): control group, I/R group, Bromocriptine group (Bro) and Haloperidol group (Hal). Myocardial ischemia/reperfusion injury of isolated rats was induced by Langendorff system; The heart function was recored by Powerlab; LDH, CK activities of coronary effluent and SOD activity and MDA content of myocardial tissue homogenate were measured by colorimetric method; Myocardial cell apoptosis was detected by TUNEL staining; The expression of DR2, Bcl- 2, caspase- 3 and caspase- 9 was detected by Western blot.ResultsCompared with control group, the expressions of DR2, Bcl- 2, caspase- 3, caspase- 9, the activity of LDH and CK, the MDA content, the rate of cell apoptosis were increased (Plt;0.01), but the SOD activity and heart function were decreased in the I/R group (Plt;0.01). Compared with I/R group, Bro decreased the activity of LDH and CK, the MDA content,

the rate of cell apoptosis, the expression of caspase- 3 and caspase- 9, increased the SOD activity and Bcl- 2 expressions, improved heart function (Plt;0.01). Hal did not change the above indexes.ConclusionsDR2 inhibites I/R injury through antioxidation that is poteintially explained by scavenging free radical, up-regulation of Bcl- 2 expressions and down-regulation of caspase- 3 and caspase- 9 expression.

dopamin receptors- 2; ischemia/reperfusion injury; apoptosis; rats; myocardium

2014- 03- 17

2014- 05- 27

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12531348)

*通信作者(correspondingauthor)：hongzhuli61@163.com

1001-6325(2014)10-1372-04

R 542.2

A