盲腸結(jié)扎法致大鼠急性腹膜炎模型研究

呂文立 朱忠才 范明勝

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·哈爾濱 150036）

本研究是益氣通下法對(duì)急性化膿性腹膜炎炎癥因子變化的實(shí)驗(yàn)性研究的一部分。通過(guò)盲腸結(jié)扎法建立大鼠急性腹膜炎動(dòng)物模型，分別觀察在不同階段炎癥因子及的變化情況，意在探討建立一種簡(jiǎn)便、易行、效果穩(wěn)定、便于獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)方法，為實(shí)驗(yàn)研究提供理想的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

選用體重180～200g的健康Wistar大鼠50只，雌雄各半，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物飼養(yǎng)合格證號(hào)ID200907028)提供。在標(biāo)養(yǎng)條件下喂養(yǎng)觀察一周后,大鼠隨機(jī)分為空白組10只和模型組40只，采血時(shí)第一次分別從各組中隨機(jī)抽取8只采血。第二次及以后隨機(jī)從模型組中抽取8只采血。

1.2 腹膜炎模型制備

實(shí)驗(yàn)前禁食12h，禁水6h。10%水合氯醛(0.33mL/100g體重)腹腔注射麻醉，麻醉顯效后,取下腹部正中切口，長(zhǎng)約2cm，輕緩提出盲腸，在距盲腸游離末端1.0cm處用1號(hào)絲線全層結(jié)扎(盲腸末端腸內(nèi)容物均勻,中等充盈)后，回納腸管，分兩層關(guān)腹，等待蘇醒。造模后自由進(jìn)食飲水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)本采集

分別在模型建立后第1、2、4、6天采血，10%水合氯醛（0.33mL/100g體重)腹腔注射麻醉，麻醉顯效后,下腹部正中切口，長(zhǎng)約5cm，輕緩提出小腸及其他腹腔內(nèi)容物，剝離并暴露腹主動(dòng)脈，采血3ml，以4000轉(zhuǎn)∕分低溫（4℃)離心15分鐘取血清，置于-80℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 標(biāo)本檢測(cè)

TNF-a，IL-6，TNF-aR濃度測(cè)定采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量檢測(cè)TNF-a，IL-6，TNF-aR的水平，ELISA法測(cè)定以上指標(biāo)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，以P＜0.05為差異有顯著性，或以P＜0.01為差異有極顯著性。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 一般情況 造模后所有動(dòng)物蘇醒后均表現(xiàn)為精神萎糜，行動(dòng)減少、遲緩，拒食、攝水量驟減，精神倦怠，蜷縮少動(dòng)，反應(yīng)遲鈍；12小時(shí)后個(gè)別病情嚴(yán)重者出現(xiàn)寒顫、毛發(fā)直立。造模24小時(shí)后，癥狀輕的動(dòng)物開始少量進(jìn)食,攝水量見增加，活動(dòng)量增加，蜷縮少動(dòng)者減少，極個(gè)別有嗜睡癥狀；48小時(shí)后模型動(dòng)物均見明顯消瘦，有個(gè)別出現(xiàn)毛發(fā)直立，但活動(dòng)量均增加；72小時(shí)后，大鼠上述癥狀明顯減輕，狀態(tài)較活躍。所有模型均無(wú)扭體現(xiàn)象發(fā)生，符合急性化膿性腹膜炎時(shí)靜臥少動(dòng)以減輕疼痛的特點(diǎn)。

2.4.2 各階段模型大鼠血清TNF-a，IL-6，TNF-aR的水平變化

2.4.2.1 TNF-a水平變化情況(見表1）

表1 TNF-a的變化（單位：pg/ml,）

表1 TNF-a的變化（單位：pg/ml,）

組別 例數(shù)（只） 造模后24小時(shí)(第1天)造模后48小時(shí)(第2天)造模后96小時(shí)(第4天)造模后144小時(shí)(第6天)空白組 8 83.84±78.07 -- -- --模型組 每次8 358.11±60.50 330.53±49.43 289.06±43.03 261.60±19.53

造模24小時(shí)后，模型組與空白對(duì)照組相比，P＜0.01，有極顯著性差異，證實(shí)造模成功。造模后48小時(shí)組與24小時(shí)組，96小時(shí)組與48小時(shí)組,144小時(shí)組與96小時(shí)組相比，P＞0.05，均無(wú)顯著性差異。

2.4.2.2 IL-6水平變化情況(見表2)

表2 IL-6的變化（單位：pg/ml,）

表2 IL-6的變化（單位：pg/ml,）

組別 例數(shù)（只） 造模后24小時(shí)(第1天) 造模后48小時(shí)(第2天) 造模后96小時(shí)(第4天) 造模后144小時(shí)(第6天)空白組 8 378.63±113.31 -- -- --模型組 每次8 124.67±48.76 122.48±47.53 141.42±111.45 295.62±74.44

造模24小時(shí)后，模型組與空白對(duì)照組相比，P＜0.01，有極顯著性差異；造模后48小時(shí)組與24小時(shí)組，96小時(shí)組與48小時(shí)組相比,P＞0.05，均無(wú)顯著性差異；144小時(shí)組與96小時(shí)組相比,P＜0.01，有極顯著性差異。IL-6水平結(jié)果先降后升，與相關(guān)資料不符，原因還需進(jìn)一步研究。

2.4.2.3 TNF-aR水平變化情況(見表3)

表3 TNF-aR的變化（單位：ng/ml,）

表3 TNF-aR的變化（單位：ng/ml,）

組別 例數(shù)（只） 造模后24小時(shí)(第1天) 造模后48小時(shí)(第2天) 造模后96小時(shí)(第4天) 造模后144小時(shí)(第6天)空白組 8 8.10±0.97 -- -- --模型組 每次8 5.44±1.45 5.61±0.65 6.12±0.39 6.54±0.32

造模24小時(shí)后，模型組與空白對(duì)照組相比，P＜0.01，有極顯著性差異；造模后48小時(shí)組與24小時(shí)組,96小時(shí)組與48小時(shí)組相比,P＞0.05，均無(wú)顯著性差異；144小時(shí)組與96小時(shí)組相比,P＜0.05，有顯著性差異。

3 討論

目前，對(duì)實(shí)驗(yàn)性腹膜炎的研究大多采用細(xì)菌性腹膜炎，常用的造模方法有很多：向腹腔內(nèi)注射純培養(yǎng)的菌液[1-3]，手術(shù)損傷盲腸[4]，向腹腔注射糞便混合物[5]和盲腸結(jié)扎法等。第一種在細(xì)菌誘發(fā)腹膜炎的動(dòng)物模型方面各家報(bào)道注菌量存在著很大差異，不同佐劑的使用可表現(xiàn)出不同作用，也可表現(xiàn)出保護(hù)作用[6]。第二種模型因手術(shù)創(chuàng)傷和腸內(nèi)容物的急性進(jìn)入腹腔，快速形成細(xì)菌性腹膜炎和化學(xué)性腹膜炎，使炎癥反應(yīng)過(guò)于急速和嚴(yán)重，模型動(dòng)物的死亡控制困難，增加實(shí)驗(yàn)難度。準(zhǔn)確的控制腹膜炎的程度，在研究中難以保持實(shí)驗(yàn)條件的齊同性、重復(fù)性與可比性，是本研究的造模難點(diǎn)之一。

本研究采用盲腸結(jié)扎法致大鼠急性腹膜炎，觀察腹膜炎的發(fā)生情況，所有動(dòng)物采血時(shí)剝腹探查可見：1～3天可見結(jié)扎處壞死、滲出、色黑；3～5天逐漸形成粘連包裹。腹膜、大網(wǎng)膜充血水腫，伴腸管脹氣，肝、脾、腸管等臟器表面，可見有少量膿性纖維性滲出物附著，腹腔滲液混濁，伴有臭味。6-7天后炎癥情況逐漸減輕，膿性滲出減少，腸壁及腹膜充血減輕，小鼠活動(dòng)性明顯改善。本模型的可控性在于結(jié)扎長(zhǎng)度和結(jié)扎部位腸內(nèi)容充盈度的控制。距末端1.0厘米結(jié)扎、充盈度中等時(shí)所形成的炎癥反應(yīng)基本可自行控制，死亡率2-5%（7天內(nèi)）；距末端1.5厘米結(jié)扎、充盈度中等者炎癥反應(yīng)較重，死亡率2～20%（7天內(nèi)）；據(jù)末端2.0厘米結(jié)扎者，死亡率五天內(nèi)可達(dá)50%。同時(shí)炎癥反應(yīng)程度與結(jié)扎時(shí)腸內(nèi)容充盈度有著極大的關(guān)系。所以本實(shí)驗(yàn)在保證結(jié)扎長(zhǎng)度時(shí)，也應(yīng)保證結(jié)扎部位充盈度的均一性，才能控制模型炎癥反應(yīng)的均一性。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，盲腸結(jié)扎的造模方法，使實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c臨床過(guò)程更加一致，基本符合急性壞疽性闌尾炎合并腹膜炎的病理演變過(guò)程。采用盲腸結(jié)扎法有著手術(shù)創(chuàng)傷小、簡(jiǎn)便易行、炎癥反應(yīng)較強(qiáng)烈，實(shí)驗(yàn)條件易于控制、齊同性、重復(fù)性較好等優(yōu)點(diǎn)。

大鼠在造模24小時(shí)后，模型組TNF-a水平相比空白組明顯升高，說(shuō)明炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，大鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)現(xiàn)象，細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的表達(dá)增高。在不同炎癥反應(yīng)階段，TNF-a水平初期劇烈，后期一直平穩(wěn)。模型組TNF-aR水平初期相比空白組明顯降低,說(shuō)明炎癥因子反應(yīng)初期是以促進(jìn)炎癥反應(yīng)為主，抑制炎癥反應(yīng)在后期才明顯增強(qiáng)，這很好地調(diào)控了炎癥反應(yīng)進(jìn)程。白細(xì)胞介素-6（IL-6）在本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的數(shù)據(jù)是在炎癥反應(yīng)初期與空白組相比較具有極顯著差異性，但數(shù)值卻與相關(guān)資料相反：炎癥反應(yīng)初期比空白組明顯降低，中期上升平穩(wěn)，后期上升明顯。具體原因有待于作進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中，從大鼠TNF-a，IL-6，TNF-aR的水平的明顯變化上可以得出：模型動(dòng)物的炎癥反應(yīng)在24小時(shí)至48小時(shí)最為明顯。所以，我們認(rèn)為盲腸結(jié)扎法制造腹膜炎模型不僅是腹膜炎實(shí)驗(yàn)研究的理想模型，而且對(duì)嚴(yán)重腹腔感染所致全身性炎癥反應(yīng)綜合征和多臟器功能衰竭及重癥感染休克的研究也將提供一個(gè)有益的方法。不同階段炎癥因子的表達(dá)為治療急腹癥提供了理論基礎(chǔ),為臨床藥物治療，促進(jìn)康復(fù)，提供系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)資料。同時(shí),在實(shí)驗(yàn)中的分組方法節(jié)省了動(dòng)物資源與成本，為其他類似實(shí)驗(yàn)做預(yù)實(shí)驗(yàn)提供了新方法；保證了樣本數(shù)量，為有意義的統(tǒng)計(jì)處理打好了基礎(chǔ)；實(shí)驗(yàn)中的采血方法能很好地預(yù)防溶血，保證了ELISA檢測(cè)的有效濃度。

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