microRNA過表達載體構(gòu)建技術(shù)的實驗研究

姜 彬

（北京大學(xué) 醫(yī)學(xué)部生化系，北京 100191）

1 microRNA概述

1993年，Lee等［1］在線蟲中發(fā)現(xiàn)了小分子單鏈非編碼RNA，其長度只有22nt，當(dāng)時命名為1in－4。這種RNA能夠通過堿基配對結(jié)合到靶mRNAlin－14的3’末端非翻譯區(qū)（3’untransIational region，3’UTR），抑制1in－14的翻譯，導(dǎo)致1in－4或lin－14的突變，從而造成線蟲發(fā)育差時表型（heterocllronlc phenotype）。2000年Reinhart等［2］又發(fā)現(xiàn)了另一個類似的具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的小分子RNA：let－7。兩者都被發(fā)現(xiàn)具有卓越的時序調(diào)節(jié)功能，因此被命名為小時序RNA（stRNA）。之后stRNA被歸入了 microRNA家族中。2001年不同國家的研究小組分別在線蟲、果蠅和人體中發(fā)現(xiàn)了這類長度為21～22nt的非編碼小分子RNA［3］，將其命名為 microRNA（簡寫為 miRNA）。在以后幾年的時間里，許多實驗室相繼發(fā)現(xiàn)了更多的miRNA，其家族成員的數(shù)量不斷擴大［4］。miRNA在自然界廣泛存在于人體、線蟲、果蠅、家鼠、擬南芥等多種動植物中，它沒有編碼功能，但在腫瘤的發(fā)生，細胞凋亡與衰老過程中起著關(guān)鍵的作用，其功能還涉及到生物體的正常發(fā)育、免疫調(diào)控、組織修復(fù)、干細胞的自我更新等生理過程。miRNA由于其分子小卻具有非常卓越的基因轉(zhuǎn)錄表達和細胞周期的調(diào)控作用而成為各國分子生物學(xué)家研究的熱點。

本實驗所涉及到的microRNA－21（簡寫為miR－21）已被發(fā)現(xiàn)在多種血液系統(tǒng)和實體器官的惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個在實體腫瘤中過表達的miRNA。Ciafre等［5］利用microarray的方法檢測了惡性膠質(zhì)瘤組織中245種microRNAs的整體表達水平，其中miR－21的表達水平明顯上調(diào)。Chan等［6］通過對原代培養(yǎng)建立的6種多形性惡性膠質(zhì)瘤細（A172、U87、U373、LN229、LN428、LN308）、正常胎兒和成人腦組織以及體外培養(yǎng)的正常的神經(jīng)膠質(zhì)細胞進行比較分析，也發(fā)現(xiàn)在惡性膠質(zhì)瘤中miR－21的表達水平大幅度升高。進一步研究表明，在培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細胞中下調(diào) miR－21的表達，可以觸發(fā)caspases的激活，從而導(dǎo)致腫瘤細胞的凋亡。這些研究表明，miR－21的異?？赡苁峭ㄟ^抑制關(guān)鍵性的凋亡相關(guān)基因的表達而促進惡性腫瘤的形成。此外，Iorio等［7］比較了乳腺癌及正常乳腺組織miR－21的表達，通過microarray和Northern印跡法驗證了miR－21在乳腺癌組織中表達上調(diào)，表明miR－21可能在乳腺癌惡性腫瘤形成中也扮演著癌基因的角色。近年來，大量的文獻報道證實了miR－21是一種致癌基因，但它的作用機制仍然不是十分清楚。到目前為止，獲得詳細描述的miR－21的靶信號通路主要有程序性細胞死亡因子4（PDCD4）［8］、原肌球蛋白1（TPMI）［9］、磷酸酯酶－張力蛋白同源物（PTEN）這3種，這幾條靶信號通路僅僅限于部分腫瘤組織中，并不能推廣到所有腫瘤組織。miR－21還可以通過作用于一個復(fù)雜的腫瘤抑制信號通路來發(fā)揮其致癌作用，包括如p53信號通路［10］等。我們看到，在絕大多數(shù)的腫瘤細胞中都存在有miR－21的上調(diào)，因此miR－21與抑癌基因的關(guān)系及其作用機制越來越受到關(guān)注。本實驗所要構(gòu)建的miR－21載體正是為了進一步研究miR－21的功能之用的，也是研究的第一步工作。

對于miRNA表達載體構(gòu)建方法的選擇，目前有兩種策略：一種策略基于miRNA／siRNA表達載體，利用統(tǒng)一表達框的miRNA過表達技術(shù)；另一種策略是從人類基因組DNA中用PCR方法擴增出miRNA的前體序列，酶切后定向插入真核表達載體，構(gòu)建miRNA真核表達載體pcDNA3.1（＋）－microRNA。轉(zhuǎn)染細胞后在載體啟動子作用下轉(zhuǎn)錄為具有“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的pre－microRNAs，通過胞內(nèi)自身的RNA聚合酶ⅢDicer的作用剪接加工成為成熟的microRNAs，從而發(fā)揮對靶基因的調(diào)控作用?？紤]到由于細胞分化是一個過程，研究微小RNA在其中的調(diào)控的作用需要有一定的觀察時間，而pcDNA3.1（＋）真核表達載體含有CMV啟動子，AMP、neo抗性基因以及BGH polyA加尾信號和SV40早期啟動子（見圖1），可以在大多數(shù)哺乳動物細胞中得到穩(wěn)定表達。因此在構(gòu)建miR－21表達基因時我們試采用了pcDNA3.1（＋）真核表達載體。

圖1 pcDNA3.1（＋）真核表達載體圖譜

2 試劑

2BS細胞（人肺成纖維細胞）由我校衰老研究中心存種，于實驗前復(fù)蘇培養(yǎng)；過表達質(zhì)粒載體選用pcDNA3.1（＋）真核表達載體，Lipofectamine 2000 Reagent購自lnvitrogen公司；PCR引物由奧科生物公司合成；PCR反應(yīng)體系購自康潤生物公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ訂購于NEB公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自BioTeke公司；感受態(tài)細胞Dh5α購自博邁德科技公司；基因測序由華大基因公司完成。

3 實驗方法

（1）首先，查找pubmad的人類基因組數(shù)據(jù)庫，顯示miR－21基因位于17q23.1，即位于該染色體的16571687－16571758bp，基因序列如下：

按照構(gòu)建miRNA的要求，在基因miR－21所在位置上下游各延長約200bp，即基因組中定位于17號染色體16571500—16571999bp的片段，得到如下序列：

序列中黑體加粗序列為與上下游引物匹配的序列部分；下劃線序列為pre－miR－21（miR－21前體）對應(yīng)基因組序列部分；雙下劃線序列為成熟miR－21所對應(yīng)的基因組序列部分。

（2）PCR擴增目的基因。使用DNA抽提試劑盒提取2BS細胞（人肺成纖維細胞）基因組DNA，利用PCR技術(shù)將上述片段從基因組DNA上擴增下來，所用PCR引物為（5’段分別帶有限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ的識別序列）：

反應(yīng)條件為：94 ℃、3min，94 ℃、30s，60 ℃、30s，72℃、45s，30個循環(huán)。

（3）電泳。將得到的PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，進行PCR產(chǎn)物分析。

（4）回收目的基因。電泳后，使用膠回收試劑盒回收目的基因片段。

（5）酶切反應(yīng)。分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ對回收的目的片段和pcDNA3.1（＋）質(zhì)?？蛰d體進行酶切。目的片段40μL酶切體系：回收的DNA片段30μL；10×緩沖液4μL；100×BSA 0.4 μL；限制性內(nèi)切酶 2μL；去離子水3.6μL。pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒空載體20μL酶切體系：質(zhì)粒載體5 μL；10×緩沖液4μL；100×BSA0.2μL；限制性內(nèi)切酶1μL；去離子水9.8μL。酶切反應(yīng)過夜。純化回收酶切過后的目的片段和質(zhì)?？蛰d。

（6）連接反應(yīng)。將上述的500bp的目的片段插入到質(zhì)粒pcDNA3.1（＋）的限制性內(nèi)切酶的BamHⅠ和EcoRⅠ位點上。即將已酶切的目的基因片段與質(zhì)粒空載進行連接。10μL的連接反應(yīng)體系：純化回收的已酶切質(zhì)粒2μL；純化回收的已酶切的目的基因片段6μL；T4DNA連接酶1μL；10×T4DNA連接酶緩沖液1μL，連接反應(yīng)過夜。

（7）轉(zhuǎn)化。將得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞Dh5α中，操作均按無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進行。

（8）篩選。在超凈工作臺中從各轉(zhuǎn)化平板上用已滅菌牙簽挑取飽滿勻稱的菌落，將其置于事先已加入適量LA液體培養(yǎng)基的搖菌管中，將搖菌管置于搖床上，37℃搖菌過夜。

（9）從轉(zhuǎn)化細菌中提取重組質(zhì)粒。采用GenStar公司的StarPrep快速質(zhì)粒小提試劑盒進行小提，采用MN公司的Plasmid DNA Purification（NucleoBond Xtra Midi／Maxi）試劑盒進行酶切鑒定后的大提。其原理均是基于堿裂解提取質(zhì)粒的方法，并結(jié)合硅膠膜吸附技術(shù)，使質(zhì)粒DNA獲得高效、專一的吸附，進而洗脫獲取重組體。

（10）酶切鑒定。采用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，酶切反應(yīng)體系為20μL雙酶切反應(yīng)體系：提取的重組質(zhì)粒5μL；10×緩沖液2μL；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ1μL；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ1μL；去離子水11μL。酶切反應(yīng)30min后，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

（11）測序。將重組質(zhì)粒送華大基因公司測序，經(jīng)DNA測序證實，目的基因片段已成功構(gòu)建到pcDNA3.1（＋）真核表達載體中。

（12）RT－PCR。將重組質(zhì)粒和空載體轉(zhuǎn)染入Hela細胞進行培養(yǎng)，而后提取RNA，進行RT－PCR（反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）實驗。由于miRNA過于短小，因而采用了特殊的逆轉(zhuǎn)錄引物序列，以下黑體加粗的序列為與miR－21互補的序列：

PCR體系一般為20μL，包含合成的cDNA模板2 μL，特異性引物1μL，10mM dNTP 1μL，1uTaqDNA聚合酶1μL，25mMMgc 12μL。共進行25個循環(huán)，每個循環(huán)包含95℃變性20s，56～60℃退火1min，72℃延伸30s。對于miR－21模板使用miR－21的RT產(chǎn)物，內(nèi)參GAPDH的模板使用cDNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠成像系統(tǒng)進行分析。

4 結(jié)論

4.1 miR－21PCR擴增結(jié)果

miR－21PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示見圖2。圖2中左側(cè)為不同溫度下，以2BS細胞基因組DNA為模板進行PCR得到的產(chǎn)物條帶，擴增產(chǎn)物均在大約500 bp處泳出條帶，與用于構(gòu)建過表達載體的miR－21基因片段大小的理論值相符。圖中右側(cè)為DNA mark。

圖2 miR－21PCR擴增結(jié)果

4.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

對從隨機選擇的2個菌落中所提重組質(zhì)粒進行雙酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3。圖3左側(cè)為挑出的2個單克隆菌落進行搖菌，小提質(zhì)粒，BamHⅠ和EcoRⅠ（NEB）雙酶切，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳得到的條帶?？梢妰烧呔境?個條帶，一條在約5 kbp處，另一條在約500bp處，分別與pcDNA3.1（＋）真核表達載體和所需miR－21片段大小相一致。

圖3 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

4.3 miR－21過表達載體轉(zhuǎn)染腫瘤細胞后miR－21的表達情況

利用構(gòu)建好的miR－21真核表達載體和空載體轉(zhuǎn)染Hela細胞，培養(yǎng)后提取RNA進行RT－PCR實驗。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了miR－21真核表達載體的細胞與轉(zhuǎn)染空載體的細胞相比，其miR－21的表達量顯著提高（見圖4）。證實miR－21過表達載體的構(gòu)建是準(zhǔn)確有效的，構(gòu)建工作是成功的，為下一步研究miR－21的作用機制及其功能奠定了基礎(chǔ)。

圖4 microRNA－21RT－PCR表達水平

5 結(jié)論

本實驗成功構(gòu)建了miR－21過表達載體，實驗證實，這種利用真核載體構(gòu)建microRNA過表達載體的方法符合microRNAs的一般生物合成過程和作用原理，經(jīng)濟、簡便、高效和準(zhǔn)確，效果穩(wěn)定，重復(fù)性好，符合實驗需要。構(gòu)建好的過表達載體可轉(zhuǎn)染細胞（腫瘤細胞或衰老細胞），可通過實時PCR方法［11］檢測其轉(zhuǎn)錄情況，可通過Western blot［12］檢測細胞中蛋白質(zhì)表達的變化，進一步研究miR－21的作用機理。

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