兩株高致病性PRRSV湖北分離株ORF5與Nsp2基因序列分析

楊 雷，馬慧慧，饒清宜，漆世華，溫文生，李玉萍，謝紅玲

（武漢中博生物股份有限公司，武漢430070）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染?。?］。其主要癥狀表現(xiàn)為妊娠母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙，以及各種年齡豬（特別是仔豬）的呼吸道癥狀。PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科，為一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約 15 kb，含有 9個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs）：ORF1a，ORF1b，ORFs2-7［2-3］。 PRRSV 有兩種基因型，分別為北美基因型VR-2332和歐洲基因型Lelystad 病毒（LV）［4］。 1996 年郭寶清等［5］首次從國(guó)內(nèi)疑似PRRS感染豬群中分離出PRRSV，從而證實(shí)了本病在我國(guó)的存在。2006年我國(guó)豬群暴發(fā)了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征是由高度變異的PRRSV引起的豬的烈性傳染病，已發(fā)病超過(guò)200萬(wàn)頭豬，大約有400000頭的死亡病例［6］。本研究從發(fā)病豬場(chǎng)采集病料，分離得到兩株高致病性PRRSV毒株，并對(duì)其ORF5和Nsp2序列進(jìn)行分析，為研究流行毒株的變異情況及選擇合理的毒株制備疫苗進(jìn)行免疫，以及預(yù)防和控制該病奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病料和細(xì)胞 病料：采自湖北某規(guī)模化豬場(chǎng)疑似PRRSV感染豬的肺臟和淋巴結(jié)。細(xì)胞：Marc-145細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由本公司實(shí)驗(yàn)室以常規(guī)方法培養(yǎng)、保存，外源檢測(cè)純凈。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自山東勁牛公司；RNA提取試劑盒、一步法 RT-PCR 試劑盒（Code：DRR064A）、DL8000、DNA膠回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中發(fā)表的PRRSV美洲型毒株比對(duì)結(jié)果，分別設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增ORF5和Nsp2基因的引物。其中ORF5上下游引物序列為：ORF5-1：5’ -ATGTTGGGGAAGTGCTTGACC-3’，ORF5-2：5’-CTAGAGACGACCCCATAGTTC-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為603 bp；Nsp2上下游引物序列為：Nsp2-1：5’-TAGGAAGGTCAGGTCCGATT-3’，Nsp2-2：5’-ACAGGGAGCTGCTTGATGAT-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為425 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.4 病毒分離 取1 g疑似PRRSV病死豬組織病料，加10 mL DMEM制成組織勻漿，加青霉素、鏈霉素各2000 U／mL，反復(fù)凍融 3次，4000 r／min 離心20 min，取上清用 0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌，按10%的量接種至培養(yǎng)單層的Marc-145細(xì)胞，37℃吸附1 h，加10 mL維持液并于37℃恒溫箱培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變情況。待細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變時(shí)，收毒，置-70℃保存。同上方法連續(xù)傳代，收毒時(shí)間穩(wěn)定后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 一步法RT-PCR 按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病料RNA，按照一步法RT-PCR明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下：2×一步法RT-PCR BufferⅢ 12.5 μL、上下游引物各 0.5 μL、Ex-Taq HS 0.5 μL、RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL、RAN 2 μL，加去離子水至25 μL。ORF5基因 PCR反應(yīng)程序：42℃反轉(zhuǎn)錄5 min，95℃預(yù)變性 10 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性 5 s，64 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。Nsp2基因PCR反應(yīng)程序同ORF5基因。反應(yīng)結(jié)束后分別取PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)電泳檢測(cè)。

1.6 序列分析 將瓊脂糖凝膠電泳含有目的片段的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠，按照TaKaRa公司膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的基因片段。將回收的目的片段送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNA MAN軟件分析，并和GenBank中其他PRRSV毒株的Nsp2、ORF5基因序列進(jìn)行同源性比較和分析，國(guó)內(nèi)外參考序列見(jiàn)表1。

表1 不同來(lái)源的PRRSV毒株

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離 從Marc-145細(xì)胞上成功分離到2株病毒，分別命名為HBXN和HBHS。培養(yǎng)的正常Marc-145細(xì)胞形態(tài)較好，輪廓清楚，界限清晰；2株分離毒株在Marc-145細(xì)胞上均可致典型CPE，主要表現(xiàn)：剛開(kāi)始表現(xiàn)為細(xì)胞聚集成叢，在隨后的2～3 d內(nèi)表現(xiàn)為固縮、變圓，最后細(xì)胞開(kāi)始脫落（圖1）。

圖1 正常Marc-145細(xì)胞和接毒后Marc-145細(xì)胞

2.2 一步法RT-PCR的鑒定 用設(shè)計(jì)的2對(duì)特異性引物分別進(jìn)行一步法RT-PCR，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)大小約603 bp和425 bp的特異性擴(kuò)增片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。目的基因片段經(jīng)電泳回收，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與國(guó)內(nèi)外的參考序列進(jìn)行比對(duì)分析。

圖2 PCR擴(kuò)增分離毒株目的片段電泳結(jié)果

2.3 Nsp2基因序列分析 用DNA MAN軟件對(duì)PRRSV HBXN株和HBHS株的Nsp2部分基因序列進(jìn)行分析表明，兩株分離株的Nsp2基因均有2個(gè)部位出現(xiàn)了缺失，分別為3個(gè)核苷酸和連續(xù)87個(gè)核苷酸的缺失，與國(guó)內(nèi)分離株Nsp2基因序列核苷酸缺失部分的比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖3。核苷酸同源性分析表明，兩個(gè)分離株之間Nsp2基因核苷酸與氨基酸同源性達(dá)到98.8%，與國(guó)內(nèi)分離的高致病性PRRSV毒株JXA1、GD2007、GD2008的氨基酸同源性很高，介于98.5% ～99.5%；而與 NB-04、HUN4、HB-1、WUH1高致病性毒株同源性較低（表2）。遺傳進(jìn)化樹(shù)分析表明（圖4），兩個(gè)分離株的Nsp2序列與國(guó)內(nèi)分離的高致病性PRRSV毒株JXA1、GD2007、GD2008在同一亞群中，與PRRSV疫苗株pMLV和AMERVAC、NB-04株、HUN4株、HB-1株、WUH1株、LV株存在較遠(yuǎn)的遺傳距離。

2.4 ORF5基因序列分析 用DNA MAN軟件對(duì)PRRSV HBHS株和HBXN株的ORF5基因序列進(jìn)行分析表明，兩個(gè)分離株之間ORF5氨基酸同源性達(dá)到98.6%，HBHS株和 2007年國(guó)內(nèi)流行毒株HUN4的氨基酸同源性較高，為99.5%。HBXN株與HK13株的氨基酸同源性較高，為99.0%。HBHS株和HBXN株與國(guó)外分離株pMLV株、LV株和VR2332株的氨基酸同源性較低（表3）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明（圖5），HBHS株和HBXN株的ORF5序列與國(guó)內(nèi)分離的高致病性PRRSV毒株JXA1、GD2007、GD2008、WUH1、HUN4、HK13、HB-1、NB-04的遺傳距離很近，同處一個(gè)基因群中，而與CH-1a等經(jīng)典毒株較遠(yuǎn)。

圖3 部分Nsp2基因缺失序列對(duì)比分析

表2 Nsp2部分基因序列氨基酸同源性比對(duì)分析

圖4 Nsp2部分基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖5 ORF5基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

表3 ORF5基因序列氨基酸同源性比對(duì)分析

3 討論

PRRSV各分離株基因組序列存在不同程度的差異。不同地域分離株基因組序列分析顯示，PRRSV有2種基因型，即美洲型（以VR2332為代表株）和歐洲型（以LV為代表株），歐洲型分離株間的差異較小，北美洲型分離株間的差異相對(duì)較大。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)完成多株P(guān)RRSV的全基因組序列測(cè)定［7-8］，序列分析的結(jié)果表明，PRRSV的變異分布于整個(gè)基因組，尤以O(shè)RF5基因和Nsp2基因的變異最大［9-10］。因此，對(duì)這2個(gè)基因變異的分析在一定程度上可以反映病毒基因組序列變異的情況，在研究上常作為比較PRRSV變異的靶基因。

本研究通過(guò)對(duì)HBHS株和HBXN株的Nsp2基因序列分析表明：此次分離的兩株高致病性PRRSV HBHS株和HBXN株都分別缺失了3個(gè)堿基和87個(gè)堿基，即共缺失30個(gè)氨基酸，這與國(guó)內(nèi)分離的高致病性 PRRSV毒株 JXA1、GD2007、GD2008的Nsp2高變區(qū)堿基的缺失是一致的，且具有很高的同源性。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)此次分離到的兩個(gè)分離株之間也具有很高的同源性，高達(dá)98.8%。所分離毒株臨床上具有高致病性。

PRRS不同分離株的核苷酸序列存在廣泛而且明顯的變異，ORF5基因最容易發(fā)生變異，由其編碼的GP5蛋白是PRRSV所有結(jié)構(gòu)蛋白中具有較強(qiáng)抗原性的蛋白，不僅可誘導(dǎo)產(chǎn)生與病毒的中和反應(yīng)呈顯著相關(guān)的中和抗體，還在引起特異性細(xì)胞免疫、阻止肺泡巨噬細(xì)胞損傷和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面發(fā)揮著重要作用［11］。因此，ORF5基因的變異，引起其編碼的GP5蛋白的變化，帶來(lái)抗原性的改變，最終導(dǎo)致PRRSV相關(guān)特性的改變。這可能是免疫豬群不能抵抗變異毒株攻擊而發(fā)病的原因之一。通過(guò)對(duì)ORF5序列分析發(fā)現(xiàn)，本研究中所分離的HBHS株和HBXN株的ORF5序列與國(guó)內(nèi)分離的高致病性 PRRSV毒株 JXA1、GD2007、GD2008、WUH1、HUN4、HK13、HB-1、NB-04 的遺傳距離很近，同處一個(gè)基因群中，而與CH-1a等經(jīng)典毒株較遠(yuǎn)。說(shuō)明了分離的毒株ORF5基因在很大程度上發(fā)生了變異，該結(jié)論為研究流行毒株的變異情況及選擇合理的毒株制備疫苗進(jìn)行免疫，以及預(yù)防和控制該病奠定了基礎(chǔ)。

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