丹參與黃芪配伍干預(yù)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝損害的實(shí)驗(yàn)研究

閻小女，王金茹，韓子巖

(1山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科，太原 030001;*通訊作者，E－mail:rweiliaoshi@126.com)

肝纖維化［1］是慢性肝病最重要的病理特征，是各種慢性肝病演變成肝硬化的必經(jīng)病理過(guò)程，是肝硬化和肝癌進(jìn)一步發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。目前多數(shù)抗肝纖維化治療仍處在實(shí)驗(yàn)研究階段，臨床上缺乏高效、無(wú)毒副作用的抗肝纖維化藥［2］。傳統(tǒng)中藥抗肝纖維化方面具有優(yōu)越性［3，4］，我們前期對(duì)我國(guó)抗肝纖維化中藥做了meta分析，得出眾多方劑均以丹參和黃芪作為君藥［5，6］。丹參和黃芪藥理作用不完全相同，理論上存在互補(bǔ);兩藥配伍抗肝纖維化方面報(bào)道很少。此外在四氯化碳造模過(guò)程中易出現(xiàn)以肝細(xì)胞脂肪沉積為特征的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)病理改變。故本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察丹參和黃芪對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟纖維化以及NAFLD活動(dòng)度的干預(yù)作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

將32只Wistar雄性大鼠，體重(200±20)g，隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組2只，模型組6只，丹參組8只，黃芪組8只，丹參+黃芪組8只。除正常對(duì)照組外，余30只大鼠均給予背部皮下注射40%四氯化碳橄欖油混合液0.3 ml/100 g體重，2次/周，共8周，正常對(duì)照組則給予等量的生理鹽水。中藥劑量按照成人有效劑量(60 kg體重給藥30 g)的8倍給藥;藥物干預(yù)組分別給予相應(yīng)藥物灌胃干預(yù)持續(xù)8周。殺鼠取大鼠肝右葉組織分別行HE染色和Masson染色。

1.2 病理學(xué)判定

肝細(xì)胞脂肪變、炎癥和氣球樣變參照非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)標(biāo)準(zhǔn)［7］具體如下:脂肪性肝病(NAFLD)評(píng)分為NAS(nonalcoholic fatty liver disease activity score):①肝細(xì)胞脂肪變:0分，＜5%;1分，5%－33%;2分，34%－66%;3分，＞66%。②小葉內(nèi)炎癥(20倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶):0分，無(wú);1分，＜2個(gè) ;2分，2－4個(gè);3分，＞4個(gè)。③肝細(xì)胞氣球樣變:0分，無(wú);1分，少見(jiàn);2分，多見(jiàn)。NAS(1、2、3項(xiàng)合計(jì))＞4分則可診斷NASH;無(wú)小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變和纖維化，但肝脂肪變＞33%者為NAFL，脂肪變達(dá)不到此程度者僅稱為肝細(xì)胞脂肪變。

1.3 肝臟膠原纖維測(cè)量

應(yīng)用Image Pro Plus(IPP)6.0專業(yè)圖像分析軟件對(duì)Masson染色圖片中的膠原纖維進(jìn)行測(cè)量，所選測(cè)定指標(biāo)面積(area)和積分光密度(IOD)。Masson染色的觀察:灰色區(qū)域主要為膠原纖維。光鏡下200倍隨機(jī)選取3－4個(gè)不重疊視野，用Olympus DP 71顯微攝像系統(tǒng)拍攝照片，用IPP軟件進(jìn)行膠原纖維定量分析，分析每個(gè)組織片上膠原纖維的面積(area)及積分吸光度值(IOD)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 組織病理結(jié)果

2.1.1 肝組織HE染色 正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，肝板以中央靜脈為中心呈放射狀排列，未見(jiàn)脂肪變性、炎癥和壞死。模型組可見(jiàn)粗大纖維索、假小葉形成，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變，部分氣球樣變，散在少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，丹參組和黃芪組纖維素纖細(xì)，肝細(xì)胞脂肪變、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和氣球樣變無(wú)明顯差別。與丹參組和黃芪組相比，丹參+黃芪組肝纖維素?cái)?shù)量少更纖細(xì)，而肝細(xì)胞脂肪變、炎性浸潤(rùn)、氣球樣變差別不大(圖1，見(jiàn)第545頁(yè))。

2.1.2 肝組織Masson染色結(jié)果 正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)纖維條索。模型組可見(jiàn)粗大纖維索、多個(gè)假小葉形成。與模型組相比，丹參組和黃芪組纖維素?cái)?shù)量少且更細(xì)，假小葉形成減少。與丹參組和黃芪組相比，丹參+黃芪組肝纖維素?cái)?shù)量少更纖細(xì)，假小葉形成不明顯(圖2，見(jiàn)第545頁(yè))。

圖1 五組8周大鼠肝組織光鏡下HE染色結(jié)果 (×200)Figure 1 HE staining of liver tissues in five groups at week 8 (×200)

圖2 五組8周大鼠肝組織光鏡下Masson染色結(jié)果 (×200)Figure 2 Masson staining of liver tissues in five groups at week 8 (×200)

2.2 非酒精性脂肪性肝炎評(píng)分(NAS)

模型組、丹參組、黃芪組、丹參+黃芪組四組NAS評(píng)分與正常對(duì)照組相比均有升高(P＜0.05)，而這四組間兩兩比較評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)表1)。

表1 五組大鼠NAS比較結(jié)果Table 1 Comparison of NAS among five groups

2.3 膠原纖維的測(cè)量結(jié)果

模型組的膠原纖維指標(biāo)面積(area)和積分光密度(IOD)較正常對(duì)照組均升高(P＜0.05)，3個(gè)藥物組的肝纖維面積和IOD值與模型組比較均降低(P＜0.05)，丹參+黃芪組分別與丹參組與黃芪組比較，肝纖維面積和IOD數(shù)值均更低(P＜0.05)。但丹參組與黃芪組的面積和IOD比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)表2)。

表2 大鼠肝組織膠原纖維測(cè)量值結(jié)果(±s)Table 2 Comparison of area and IOD of collagenous fibers among five groups(±s)

表2 大鼠肝組織膠原纖維測(cè)量值結(jié)果(±s)Table 2 Comparison of area and IOD of collagenous fibers among five groups(±s)

與正常對(duì)照組比較，ΔP＜0.05;與模型組相比，*P＜0.05;與丹參 +黃芪組相比，#P＜0.05

丹參 +黃芪組 22 6.36±1.92* 2.38±1.10*F 103.085 56.505 P＜0.001＜0.001

3 討論

從20世紀(jì)70年代開(kāi)始國(guó)內(nèi)外學(xué)者把中國(guó)傳統(tǒng)草藥作為抗肝纖維化的突破口［8］，目前中藥抗肝纖維化已成為國(guó)內(nèi)防治肝纖維化研究的熱點(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)有效的抗纖中草藥達(dá)50余種［9］，對(duì)慢性肝炎、肝纖維化及早期肝硬化，中醫(yī)治療多以活血化瘀為主，兼以益氣補(bǔ)虛和養(yǎng)血柔肝。我們前期對(duì)國(guó)內(nèi)六大抗肝纖維化成方進(jìn)行meta分析，得出前述六方的交集藥味為丹參和黃芪，且丹參和黃芪是抗肝纖維化的有效中草藥［5，6］，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明丹參和黃芪治療肝纖維有效［10］。

本實(shí)驗(yàn)丹參組的膠原纖維面積和IOD測(cè)量結(jié)果較模型組低，說(shuō)明丹參是有效的抗肝纖維化草藥。丹參［11］的有效化學(xué)成分主要分為脂溶性的二萜醌類和水溶性的酚酸類，前者包括丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮、丹參甲酯、丹參新酮、二氫丹參酮Ⅰ、次甲丹參酮等，后者主要包括丹參素、原兒茶醛、丹參酸B等?，F(xiàn)代藥理研究、臨床觀察及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明丹參有顯著抗肝纖維化作用［12，13］，可抑制HSC的增殖和膠原的合成，促進(jìn)膠原的降解、改善肝臟內(nèi)血液微循環(huán)、增加肝內(nèi)源性SOD活性，清除氧自由基，減低肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)、抑制炎癥及炎性因子釋放起到抗肝纖維化作用。CCl4引起肝纖維化最重要原因是自由基及其脂質(zhì)過(guò)氧化，故抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷可起到抗纖維化并保護(hù)肝細(xì)胞作用。

本實(shí)驗(yàn)黃芪組的膠原纖維面積和IOD測(cè)量結(jié)果較模型組低，說(shuō)明黃芪可減輕肝臟內(nèi)膠原纖維成分沉積，它是有效的抗肝纖藥。黃芪［14］化學(xué)成分主要包括為多種黃酮類、三萜皂苷類、多糖類、多種氨基酸、維生素和微量元素等。黃芪［14，15］通過(guò)增強(qiáng)肝星狀細(xì)胞間質(zhì)性膠原酶的基因表達(dá)而促進(jìn)沉積膠原的降解，能抑制成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、降低血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、保護(hù)肝細(xì)胞膜、抗脂質(zhì)過(guò)氧化及抗氧自由基。

本研究還發(fā)現(xiàn)丹參+黃芪組膠原纖維表達(dá)均少于丹參組和黃芪組，說(shuō)明丹參和黃芪兩藥聯(lián)合抗肝纖維化優(yōu)于單藥的作用，可能與兩藥抗肝纖維化的不同途徑互補(bǔ)有關(guān)。但前述兩藥對(duì)非酒精性脂肪性肝炎的活動(dòng)度(NAS)無(wú)影響。關(guān)于中藥抗肝纖維化深入而準(zhǔn)確的機(jī)制，需要我們進(jìn)一步探索;加之中藥成分復(fù)雜，有效成分的提純和分析是未來(lái)需要深入研究的重點(diǎn)方向。

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